พันธุวิศวกรรมศาสตร์ วิศวกรรมพันธุศาสตร์ Genetic engineering การตัดต่อ ดัดแปลง เพิ่มจำนวน สารพันธุกรรม เทคโนโลยีชีวภาพ สาขาหนึ่ง ระดับโมเลกุล (molecular biology) ระดับนาโน (nanotechnology)

ด้านการเกษตร อุตสาหกรรม การแพทย์ ฯลฯ Biotechnology Biotechnology หรือ เทคโนโลยีชีวภาพ คำจำกัดความ.. ด้านการเกษตร อุตสาหกรรม การแพทย์ ฯลฯ - Tissue culture Gene technology ดัดแปลงลักษณะที่เอื้อต่อผู้ผลิต ดัดแปลงลักษณะที่เอื้อต่อผู้บริโภค การปรับปรุงพันธุ์พืช

Why genetic engineering ? การพัฒนาพันธุ์แบบดั้งเดิม ผสมพันธุ์ และ คัดเลือก เพื่อวัตถุประสงค์เฉพาะ ความหลากหลายทางพันธุกรรม วิวัฒนาการ นักผสมพันธุ์

ข้อจำกัดของการผสมพันธุ์ - ความหลากหลายทางพันธุกรรมไม่เพียงพอ ไม่มีลักษณะที่ต้องการ (limited gene pool) - ความห่างทางพันธุกรรม ไม่สามารถผสมข้ามได้ - ใช้ระยะเวลานานในการคัดเลือกพันธุ์ Mutation & Gene Technology เทคนิคช่วยเสริม หรือ ลดข้อจำกัดลง

เพื่อใช้ในการดัดแปลงพันธุกรรม และอื่นๆ องค์ประกอบสำคัญ: Gene/DNA cloning Clone: breeding = tissue culture = genetic engineering = Cloning: การเพิ่มปริมาณยีน หรือ ดีเอ็นเอ ที่ต้องการ เพื่อใช้ในการดัดแปลงพันธุกรรม และอื่นๆ องค์ประกอบสำคัญ: ดีเอ็นเอที่ตัองการโคลน ดีเอ็นเอพาหะ (cloning vector, DNA vector) เซลล์เจ้าบ้าน (host cell) The purpose of cloning is to obtain a quantity of the desired gene for genetic modification.  Two molecules are required for cloning: the DNA to be cloned and a cloning vector

ดีเอ็นเอในจีโนม (Genomic DNA) ปริมาณมาก ประกอบด้วย ส่วนที่เป็นยีน และ ไม่ใช่ยีน แบ่งจีโนมให้มีขนาดเล็กลง (ตัดดีเอ็นเอให้สั้นลง) ก่อนการเพิ่มปริมาณ

ขั้นตอนโดยทั่วไปในการทำโคลนนิ่ง เตรียมดีเอ็นเอที่ต้องการโคลน (ตัดด้วยเอนไซม์ หรือ เพิ่มปริมาณด้วยปฏิกิริยาจำเพาะ) เตรียมเวคเตอร์ ต่อดีเอ็นเอที่ต้องการ เข้ากับ ดีเอ็นเอเวคเตอร์ ถ่ายย้ายเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน General Steps of Cloning with Any Vector: 1. Isolate of the DNA to be cloned 2. Prepare the vector and DNA by digestion with restriction enzymes to generate complementary ends 3. Ligate the DNA into the vector with the enzyme DNA ligase  4. Introduce the DNA into bacterial cells (or yeast cells for some cloning vector) by transformation 5. Allow the newly inserted segment to replicated along with the rest of the plasmid in cells. 6. Select cells containing foreign DNA by screening for selectable markers (usually drug resistance) 7. Purify the DNA

ขั้นตอนโดยทั่วไปในการทำโคลนนิ่ง คัดเลือกเซลล์ที่มีดีเอ็นเอที่ต้องการ เพิ่มปริมาณเซลล์ที่คัดเลือก สกัดแยกดีเอ็นเอที่ต้องการ นำไปใช้งานต่อไป

DNA vector ดีเอ็นเอที่มีคุณสมบัติจำเพาะ จาก แบคทีเรีย ไวรัส ยีสต์ หรือ สร้างขึ้น (artificial chromosome) นำดีเอ็นเอแปลกปลอมเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน (แบคทีเรีย หรือ ยีสต์) เพื่อการจำลองตัว เป็นการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ

คุณสมบัติของเวคเตอร์ - มี multiple cloning region, MCR multiple cloning site, MCS เพื่อนำดีเอ็นเอที่ต้องการเพิ่มปริมาณเข้าไปแทรก มี origin of replication, ORI เพื่อเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในเซลล์เจ้าบ้าน มี selectable marker** ให้ฟีโนไทป์ใหม่ เพิ่อการคัดเลือกเซลล์เจ้าบ้านที่มีดีเอ็นเอแปลกปลอม **นำไปสู่ข้อขัดแย้งเกี่ยวกับพืชดัดแปลงพันธุกรรมในยุคแรกๆ

ชนิดของเวคเตอร์ plasmid bacteriophage cosmids phagemid bacterial artificial chromosomes (BAC), yeast artificial chromosomes (YAC)

ดีเอ็นเอขนาดเล็กในแบคทีเรีย แยกเป็นอิสระจากโครโมโซมหลัก Plasmid ดีเอ็นเอขนาดเล็กในแบคทีเรีย แยกเป็นอิสระจากโครโมโซมหลัก bacterial DNA = chromosomal DNA plasmid DNA รูปวงกลม ขนาด 2000 – 200000 คู่เบส (2-200 kilobasepair, kbp)

Plasmid ขนาดของพลาสมิดในการทดลอง โดยทั่วไป ประมาณ 3-4 กิโลเบส รับดีเอ็นเอใหม่ (insert) ได้ถึง 10 กิโลเบส ใช้เป็นพาหะนำดีเอ็นเอขนาดเล็กเข้าสู่เซลล์

ข้อดีของพลาสมิดขนาดเล็ก ถ่ายย้าย เข้าสู่เซลล์เจ้าบ้านได้ง่าย พบตำแหน่งตัดด้วยเอนไซม์ ไม่ซ้ำซ้อนมาก unique sites for restriction enzyme การเพิ่มจำนวนทำได้เร็ว

pBR322 plasmid

Ampicillin resistance gene Selectable marker Ampicillin resistance gene ori MCS

พบในไวรัส โครงสร้างเป็นเส้นตรง หรือวงกลม Bacteriophage พบในไวรัส โครงสร้างเป็นเส้นตรง หรือวงกลม ดีเอ็นเอเส้นคู่ เส้นเดี่ยว หรืออาร์เอ็นเอเส้นเดี่ยว มีประสิทธิภาพมากกว่าพลาสมิด ในการนำดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้านอีโคไล รับดีเอ็นเอขนาดใหญ่เมื่อเทียบกับพลาสมิด เช่น bacteriophage lambda Bacteriophage lambda - much more efficient infection of E. coli than achieved by plasmid transformation T phage The genome of all of these phages consists of a single linear molecule of dsDNA. However, circular forms and/or circular permutations exist. All undergo lytic growth exclusively Bacteriophage lambda, which infects E. coli, is the classic example of a temperate bacteriophage. It has a linear dsDNA genome, which circularizes after infection, of 48,502 bp. Bacteriophage lambda has been one of the work-horses of molecular biology particularly as a model system for understanding gene regulation. It has also played an important role as a cloning vector.

ส่วนที่เป็น head และ tail โปรตีนห่อหุ้ม สารพันธุกรรม โครงสร้างประกอบด้วย ส่วนที่เป็น head และ tail โปรตีนห่อหุ้ม สารพันธุกรรม The small DNA bacteriophages have ssDNA genomes which replicate as dsDNA intermediates. They encode 10-12 proteins the filamentous phage (M13, fd, f1) have a filamentous capsid with a circular ssDNA molecule. The genome, 6407 nt, contains 10 genes but none for a lysis protein. Virions are enveloped. The filamentous phage will only infect E. coli cells carrying the F plasmid since the phage must adsorb to the F pilusto gain entry to the cells. Their life-cycle involves a dsDNA intermediate replicative form within the cell which is converted to a ssDNA molecule prior to encapsidation. they provide an easy means to prepare ssDNA for DNA sequencing.

Bacteriophage lambda The ssRNA bacteriophages are the simplest viruses known. Both families (MS2, R17 and f2 form one family; Q beta forms another) have small genomes (3600-4200 nt; MS2 is 3569 nt) that encode 4 proteins. In the MS2 family these are: a capsid coat protein, a replicase, a lysis protein, and an attachment protein that is needed for attachment of the phage to a host cell. In Q beta these are: a capsid coat protein which also has lysis activity, a replicase, a minor virion protein, and an attachment protein. All have linear ssRNA genomes. Because of this, they have served as useful sources of RNA for studies of translation and protein synthesis

วงจรชีวิตของเฝจแลมบ์ดา lysogenic cycle ดีเอ็นเอแทรกในโครโมโซมเจ้าบ้าน lytic cycle ดีเอ็นเอเป็นอิสระ สร้างไวรัสโมเลกุลใหม่ เซลล์เจ้าบ้านแตก

Phage lambda life cycle

Host cell หรือ เซลล์เจ้าบ้าน เซลล์รับดีเอ็นเอเพื่อการเพิ่มปริมาณ หรือตรวจสอบคุณสมบัติ การแสดงออกของยีน เซลล์เจ้าบ้านที่ดีต้องมีประสิทธิภาพในการรับดีเอ็นเอ เรียกว่า competent cell ตัวอย่าง เช่น แบคทีเรีย E. coli Since DNA is a very hydrophilic molecule, it won't normally pass through a bacterial cell's membrane. In order to make bacteria take in the plasmid, they must first be made "competent" to take up DNA. This is done by creating small holes in the bacterial cells by suspending them in a solution with a high concentration of calcium. DNA can then be forced into the cells by incubating the cells and the DNA together on ice, placing them briefly at 42oC (heat shock), and then putting them back on ice. This causes the bacteria to take in the DNA. The cells are then plated out on antibiotic containing media Competency The procedure to prepare competent cells can sometimes be tricky. Bacteria aren't very stable when they have holes put in them, and they die easily. A poorly performed procedure can result in cells that aren't very competent to take up DNA. A well- performed procedure will result in very competent cells. The competency of a stock of competent cells is determined by calculating how many E. coli colonies are produced per microgram (10 -6 grams) of DNA added. An excellent preparation of competent cells will give ~108 colonies per ug. A poor preparation will be about 10 4 / ug or less. Our preps should be in the range of 10 5 to 10 6.

การตัด หรือ ย่อย ดีเอ็นเอที่ตำแหน่งเฉพาะ ด้วยเอนไซม์ ตัดจำเพาะ Digestion การตัด หรือ ย่อย ดีเอ็นเอที่ตำแหน่งเฉพาะ ด้วยเอนไซม์ ตัดจำเพาะ restriction endonuclease restriction nuclease restriction enzyme ในสภาวะที่เหมาะสม อุณหภูมิ บัฟเฟอร์ ความเข้มข้นของเกลือ

ลำดับเบสเหมือนกันบนดีเอ็นเอทั้ง 2 เส้น 5’ NNGAATTCNN 3’ Restriction enzyme Recognition site ตำแหน่งจดจำบนดีเอ็นเอ ความยาว 4-8 เบส ลำดับเบสเหมือนกันบนดีเอ็นเอทั้ง 2 เส้น 5’ NNGAATTCNN 3’ 3’ NNCTTAAGNN 5’ ตัด/ย่อย phosphodiester bond ระหว่างเบส ที่ตำแหน่งเดียวกันบนดีเอ็นเอทั้ง 2 เส้น

ปลายของดีเอ็นเอที่ได้หลังการตัด Restriction end blunt end ปลายทู่ sticky end ปลายเหนียว 5’ sticky end 3’ sticky end

ตำแหน่งจดจำ ตัดระหว่าง G & A การตัดดีเอ็นเอด้วย เอนไซม์ EcoRI 5’ sticky end การตัดดีเอ็นเอด้วย เอนไซม์ EcoRI

การต่อดีเอ็นเอ 2 โมเลกุล โดยนิวคลีโอไทด์ที่จะต่อได้ Ligation การต่อดีเอ็นเอ 2 โมเลกุล โดยนิวคลีโอไทด์ที่จะต่อได้ ต้องมีปลาย 3’ OH และ 5’ P เอนไซม์ไลเกส (ligase) ทำหน้าที่ เชื่อม phosphodiester bond ระหว่าง 2 nt cofactor: ATP, NAD เช่น T4 ligase, T7 ligase, E. coli ligase

Ligation of Sticky Ends ดีเอ็นเอเส้นคู่เชื่อมกันด้วยพันธะไฮโดรเจนระหว่างคู่เบส (complementary bases) เอนไซม์ไลเกสเชื่อมพันธะระหว่างเบส บนดีเอ็นเอเส้นเดียวกัน

มีพันธะ H เชื่อมโมเลกุล Sticky end ต่อง่ายกว่า มีพันธะ H เชื่อมโมเลกุล Blunt end ต่อยากกว่า เชื่อม 2 จุดพร้อมกัน

DNA insert plasmid religated plasmid recombinant DNA

การนำดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน Transformation Transgene Transformed cell Transformant Transgenic organisms Genetically Modified Organisms, GMOs Transgenic plant GM plant

Transformation การนำดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์แบคทีเรีย กระตุ้นด้วยความร้อน heat shock กระตุ้นด้วยกระแสไฟฟ้า electroporation เยื่อหุ้มเซลล์เกิดช่องว่างชั่วคราว เป็นทางผ่านของดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์

Selection การคัดเลือกเซลล์ที่เป็น transformant ใช้ฟีโนไทป์ที่ได้จากเวคเตอร์ (selectable marker) เลี้ยงแบคทีเรียบนอาหารเลี้ยงเชื้อ นำโคโลนีที่เจริญ ไปเพิ่มปริมาณต่อไป

Bacterial transformation

Bacterial transformation

Transgenic bacteria เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ (replication) ใช้เพื่อศึกษาการแสดงออกของยีน เป็นแหล่งผลิตโปรตีน เช่น ฮอร์โมน หรือ ยา (transcription / translation)