นางสาวดรุณรัตน์ แก้วมูล รหัสนักศึกษา

งานนำเสนอเรื่อง: "นางสาวดรุณรัตน์ แก้วมูล รหัสนักศึกษา"— ใบสำเนางานนำเสนอ:

1 นางสาวดรุณรัตน์ แก้วมูล รหัสนักศึกษา 51312305
นางสาวดรุณรัตน์ แก้วมูล รหัสนักศึกษา สถานที่ทำงาน โรงพยาบาลศิริราช ภาควิชานิติเวช สาขาวิชานิติพิษวิทยา ตำแหน่ง ผู้ปฏิบัติงานวิทยาศาสตร์การแพทย์

2 อาจารย์ ดร. ศุภชัย ศุภลักษณ์นารี
อาจารย์ที่ปรึกษา อาจารย์ ดร. ศุภชัย ศุภลักษณ์นารี

3 Long-term stability of various drugs and metabolites in urine, and
preventive measures against their decomposition with special attention to filtration sterilization.

4 ของยาในปัสสาวะและมาตรการป้องกัน ไม่ให้ยาเกิดการสลายตัวโดยเฉพาะด้วย
ความคงตัวระยะยาวและMetabolite ของยาในปัสสาวะและมาตรการป้องกัน ไม่ให้ยาเกิดการสลายตัวโดยเฉพาะด้วย การกรองแบบปราศจากเชื้อ

5 Author Kei Zaitsu Akihiro Miki Munehiro Katagi Hitoshi Tsuchihashi

6 ปัญหาในการตรวจวิเคราะห์ยาและสารเสพติดในสิ่งส่งตรวจประเภทปัสสาวะ
- การปนเปื้อนแบคทีเรียและการเสื่อมสภาพของปัสสาวะ - วิธีการเก็บรักษาสภาพสิ่งส่งตรวจประเภทปัสสาวะ - การสลายตัวของยาและสารเสพติดในปัสสาวะ การพัฒนาวิธีการเก็บสิ่งส่งตรวจประเภทปัสสาวะเพื่อตรวจวิเคราะห์ยาและสารเสพติด - Aseptic Collection Kit - การเติม Sodium azide (สารกันบูด) - อุณหภูมิ

7 ผู้ต้องหา/ผู้เสียหาย
ความเป็นมา ผู้ต้องหา/ผู้เสียหาย มีสิทธ์ร้องขอให้มี การตรวจวิเคราะห์ซ้ำ

8 ผลการตรวจวิเคราะห์น่าเชื่อถือ
การตรวจวิเคราะห์ซ้ำ ครั้งแรก = ครั้งหลัง ผลการตรวจวิเคราะห์น่าเชื่อถือ

9 ผลการตรวจวิเคราะห์ไม่น่าเชื่อถือ
การตรวจวิเคราะห์ซ้ำ ครั้งแรก = ครั้งหลัง ผลการตรวจวิเคราะห์ไม่น่าเชื่อถือ

10 Forensic Urine sample Unknown Drug / Concentration
Contaminate More/Less Infection/natural Collect Non aseptic Transport Expose to ambient temperature

11 Expose to ambient temperature
Effect bacteria ผลการตรวจ ครั้งแรก = ครั้งหลัง

12 ผลการตรวจวิเคราะห์ไม่น่าเชื่อถือ
การตรวจวิเคราะห์ซ้ำ ครั้งแรก = ครั้งหลัง ผลการตรวจวิเคราะห์ไม่น่าเชื่อถือ Critical Cut off

13 1 ng / ml 1 2

14 Drug Methamphetamine (MA) Cocaine (COC) Estazolam (EZ)
6-acetylmorphine (6AM) 7-aminoflunitrazepam (7AF) Amphetamine (AP) Nitrazepam (NZ)

15 Drug detected in urine unchanged forms MA COC EZ

16 metabolites of grate forensic
Drug metabolites of grate forensic proof of intake of their parent drugs AP 6AM and 7AF

17 Drug readily decomposed by bacteria indicator of bacteria propagation NZ

18 common ester-type drug และ metabolite ที่จะ hydrolyzed ได้
COC and 6AM

19 quadrupole mass spectrometer
Shimadzu LCMS-QP2010 HPLC quadrupole mass spectrometer

20 Experimental

21 เก็บปัสสาวะจากอาสาสมัคร 24 คน
เก็บปัสสาวะจากอาสาสมัคร 24 คน ชาย =12 หญิง =12 (18 – 58 ปี) ตรวจนับจำนวน bacteria Standard Methods of Analysis in Health Scienc

22 Sample ปนเปื้อนน้อย ปนเปื้อนรุนแรง หญิง 29 ปี ชาย 27 ปี
10,000,000 cell ชาย 27 ปี 1900 cell ปนเปื้อนน้อย ปนเปื้อนรุนแรง

23 Sample ความเข้มข้น 500 ng/mL MA AP NZ EZ 7AF COC 6AM

24 เฉพาะ EZ, NZ และ 7AFเก็บไว้ในที่มืด
Sample กรอง 25˚C NaN3 0.5 wt% 6 เดือน MA AP - NZ - EZ - 7AF - COC - 6AM 4˚C กรอง+NaN3 -20˚C ไม่ใส่ เฉพาะ EZ, NZ และ 7AFเก็บไว้ในที่มืด

25 ชุดกรองปัสสาวะปราศจากเชื้อ

26 ทดสอบประสิทธิภาพชุดกรองปัสสาวะปราศจากเชื้อ
ปัสสาวะ 24 คน กรองด้วยชุดกรอง LB (Luria-Bertani) media ไม่พบ Bacteria

27 Sample ปัสสาวะ 600 ul IS 10 ug/mL DBA ปริมาณ 30 ul กรองผ่าน membrane
0.45 um

28 Results

29 Selectivity Table 1.doc Fig 2
obtained by the automated on-line extraction LC–MS of seven drugs and metabolites in urine at 500 ng/mL each

30 Stability of MA and AP Fig. 3. Time-course changes in the concentrations of MA and AP in the severely contaminated urine under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; () with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C).

31 Stability of MA and AP MA ลดลง 32 % AM ลดลง 44 %
Fig. 3. Time-course changes in the concentrations of MA and AP in the severely contaminated urine under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; ( ) with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C).

32 ยับยั้งการสลายตัวของMAและAM
aseptic collection kit NaN3

33 4 ราย ไม่มีการเปลี่ยนแปลง
ศึกษาเพิ่ม เก็บที่ 25 C/150 วัน 5 ราย 1 ราย MA % AM % 4 ราย ไม่มีการเปลี่ยนแปลง

34 ยับยั้งการสลายตัวของสาร
aseptic collection kit NaN3

35 ทดสอบ MA เปลี่ยนฟอร์มเป็น AM
Enzyme

36 ศึกษาเพิ่ม LC-MS เก็บที่ 25˚C 30 วัน MA ความเข้มข้น 500 ng/mL
No trace AM MA เก็บที่ 25˚C 30 วัน

37 Stability of MA and AP การลดลงของ MA และ AM
เกิดจาก Bacteria ทำปฏิกิริยา reductive กับ Nitrogen biological แยก carbon – carbon bonds Amine

38 Stability of MA and AP ดังนั้นการสูญเสีย MA และ AM เป็นไปได้ว่าเกิดจากการ Break carbon – carbon bonds โดย Bacteria

39 ผลการวิจัย Clauwaert et al
3,4-methylenedioxy derivatives of MA and AP Urine without preservative room temperature MA and AP มีความคงตัวอยู่ได้ถึง 21 weeks

40 Stability of NZ and EZ Fig. 3. Time-course changes in the concentrations of NZ and EZ in the severely contaminated urine under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; () with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C).

41 Stability of NZ and EZ -20˚C / 150 วัน /All NZ and EZ ไม่เปลี่ยนแปลง
ปนเปิ้อนรุนแรง /25˚C / 14 วัน / no preserve ตรวจไม่พบ NZ ปนเปิ้อนเล็กน้อย/ 25˚C / 14 วัน / no preserve NZ ค่อยๆลดลงช้าๆ ช้ากว่า 5 เท่า

42 Stability of NZ and EZ Oxygen-sensitive enzyme จาก Bacteria
จะทำปฏิกิริยา reducing กับ nitroaromatic compounds amine NZ เป็นสารพวก nitrobenzodiazepienes เปลี่ยนรูปเป็น 7-amino-metabolites โดย bacteria ( bacteria in the gastrointestinal tract reduction nitrobenzene )

43 detected 7- aminonitrazepam which losses of NZ were detected.
Stability of NZ and EZ detected 7- aminonitrazepam in all the samples in which losses of NZ were detected.

44 Stability of NZ and EZ Robertson and Drummer reported
NZ was stable up to 24 months when samples were stored at 4 C

45 ป้องกันการสลายตัวของ NZ
aseptic collection kit NaN3

46 Stability of 7AF Fig. 5. Time-course changes in the concentration of 7AF in the severely contaminated urine under various storage conditions (●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; ( ) with filtration and NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; (♦ ) with NaN3, at 4 °C; ( ) with filtration and NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C).

47 Stability of 7AF NaN3 + กรอง / ยับย้งการสลายตัวของ 7AF ได้ดีที่สุด
- 20˚C / 150 วัน /7AF ไม่เปลี่ยนแปลง ปนเปื้อนรุนแรง/ ปนเปื้อนเล็กน้อย / 150 วัน/ สูญเสีย 7AF เล็กน้อยเหมือนกัน กรอง / สูญเสีย 7AF เล็กน้อยเหมือนกัน NaN3 / สูญเสีย 7AF ปานกลางเหมือนกัน NaN3 + กรอง / ยับย้งการสลายตัวของ 7AF ได้ดีที่สุด

48 ทดสอบ การ Adsorption 7AF บนผิวหน้าของ Vessel

49 ทดสอบ Adsorptions A B C D 7AF แต่ละความเข้มข้น (250 – 2000 ng/mL)
กรองด้วยชุดกรอง เก็บไว้ 30 วัน

50 ทดสอบการ Adsorption 7AF ลดลง ไม่ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของสาร
100 ng/mL ในทุกความเข้มข้นของสารแต่ละความเข้มข้น (A B C D) 7AF ลดลง ไม่ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของสาร

51 Adsorption ที่ผิวหน้าของ Vessel
7AF ลดลง เกิดจากการถูก Adsorption ที่ผิวหน้าของ Vessel

52 Stability of 7AF ลดลงเองตามธรรมชาติ เพราะตัวมันเองไม่ stable
Robertson and Drummer : Normal blood /4, 22 and 37 C / sodium fluoride สูญเสีย 7AF 10% ในระยะเวลา 28 วัน bacteria-contaminated blood /22 C. สูญเสีย 7AF ประมาณ 10% ในระยะเวลา 2 วัน Normal blood /-20 C / sodium fluoride 7AF ลดลง

53 ต่างกัน Robertson and Drummer Normal blood /-20 C / sodium fluoride
Stability of 7AF ต่างกัน Robertson and Drummer Normal blood /-20 C / sodium fluoride 7AF ลดลง ตัวอย่างที่ศึกษาไม่เหมือนกัน เลือด กับ ปัสสาวะ จึงให้ผลที่ต่างกัน

54 ป้องกันการสลายตัวของ 7AF
aseptic collection kit NaN3

55 Stability of COC and 6AM Fig. 7. Time-course changes in the concentration of COC and 6AM in the severely contaminated urine under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; ( ) with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C).

56 Stability of COC and 6AM ปนเปื้อนรุนแรง/ no preservative /- 20˚C / 150 วัน / 7AF ไม่เปลี่ยน ปนเปื้อนรุนแรง/ no preservative / 4˚C/ 150 วัน/ COC และ 6AM ไม่เปลี่ยน ปนเปื้อนรุนแรง/ no preservative / 25˚C/ 30 วัน/ COC และ 6AM หายไป ปนเปื้อนเล็กน้อย/ no preservative / 25˚C/ 30 วัน/ COC และ 6AM หายไป ปนเปื้อนรุนแรง/ NaN3 / 25˚C/ 75 วัน/ ตรวจไม่พบ COC ปนเปื้อนรุนแรง/ NaN3 / 25˚C/ 75 วัน/ 6AM สูญเสียไป 75 %

57 Stability of COC and 6AM จากผลการทดลองพบว่า เมื่อกรอง
ให้ผลดีในการรักษา COC และ 6AM แต่กลับพบว่าเมื่อใช้ กรอง + NaN3 กลับให้ได้ผลไม่ดี มีการสูญเสีย COC และ 6AM แสดงว่า NaN3 มีผลทำให้ สูญเสีย COC และ6AM

58 Stability of COC and 6AM COC and 6AM hydrolyzed เองหรือ/และ ด้วย enzymatically เปลี่ยน ฟอร์มเป็น benzoylecgonine methylecgonineและเปลี่ยนเป็น morphine การเกิด hydrolysis จะเกิดขั้นในสภาวะที่เป็นด่าง อัตราการ hydrolysis ในปัสสาวะที่ปนเปื้อนรุนแรงจะเร็วกว่าปัสสาวะที่ปนเปื้อนเล็กน้อยหลายเท่า เป็นไปได้สูงที่ว่าการเกิด hydrolysis ภายใต้สภาวะที่มี pH สูงทำให้bacteria แพร่พันธุ์

59 Stability of COC and 6AM NaN3 มีผลต่อการสลายตัวของยาเนื่องจาก azide anion functions เป็น a strong nucleophile จับกับ carbonyl carbon และเป็นไปทำให้เกิด hydrolysis ของ ester bond ในสภาวะเบสอ่อน

60 Stability of COC and 6AM , Fuller and Anderson: 12 weeks /20 C/
0.1 wt% NaN3/ มีการลดลง 6AM ผลการทดสอบต่างมีความแตกกต่างกันเป็นไปได้เนื่องจากระยะเวลาในการศึกษาต่างกัน 90 กับ 150 วันและความเข้มข้น NaN3 ที่ใช้ในการทดสอบต่างกัน 0.1 wt% กับ 0.5 wt% ,

61 ชุดกรองเก็บปัสสาวะแทน NaN3
Stability of 6AM เพื่อป้องกันไม่ให้ปริมาณ 6AM สูญหาย ชุดกรองเก็บปัสสาวะแทน NaN3

62 สรุปและวิจารณ์ผลการทดลอง
การใช้ Aseptic collection of urine specimens ในการกรอง สิ่งส่งตรวจประเภทปัสสาวะที่คณะผู้วิจัยได้คิดค้นขึ้นมามีประสิทธิภาพในการลดการสลายตัวยาในสิ่งส่งตรวจประเภทปัสสาวะได้ การใช้ Aseptic collection of urine specimens ในการกรองปัสสาวะเป็นวิธีที่ลดการปนเปื้อนของแบคทีเรียที่ดีกว่าการใช้ Sodium azide เป็นสารกันบูดในปัสสาวะ

63 ความคิดเห็นที่มีต่องานวิจัย
การเก็บตัวอย่างที่อุณหภูมิ -20 และ 4 องศาเซสเซียสเป็นอุณหภูมิที่เหมาะสมที่สุดตามลำดับ ตัวอย่างมีข้อจำกัดต้องอยู่ที่ 25 องศาเซสเซียสจะต้องมีการกรองหรือและใช้ NaN3 เพื่อยั้บยั้งการสลายตัวของสาร งานวิจัยนี้สามารถนำไปประกอบเป็นข้อมูลของคู่มือการส่งตรวจทางนิติเวชได้ อาจจะพัฒนาไปสู่การผลิตชุดกรองที่มีสารเคมีที่เหมาะสมในการยับยั้งการสลายตัวของยาโดยไม่รบกวนตัวยา ศึกษาว่าควรใช้ภาชนะใดที่สามารถเก็บรักษาปัสสาวะ โดยที่สารไม่ถูก Adsorption โดยพื้นผิวของภาชนะ ศึกษาในความคงตัวของยาในตัวอย่างอื่นๆ เช่น ผม เล็บ

64 จบการนำเสนอ ขอบคุณค่ะ