RNA synthesis and processing รัชนีกร กัลล์ประวิทธ์

งานนำเสนอเรื่อง: "RNA synthesis and processing รัชนีกร กัลล์ประวิทธ์"— ใบสำเนางานนำเสนอ:

1 RNA synthesis and processing รัชนีกร กัลล์ประวิทธ์
รัชนีกร กัลล์ประวิทธ์ 2557

2 Gene : ส่วนของ DNA ที่ transcribe ไปเป็น RNA หรือ protein
Central Dogma DNA RNA protein RNA synthesis (transcription) เป็นขั้นตอนแรกในการแสดงออกของยีน โดยการแปลรหัสจากเบสบนสาย DNA มาเป็นลำดับเบสของ RNA

3 Transcription : ถูกควบคุมในทุกเซลล์
ใน prokaryotes  3% ของยีนจะมี transcription ในขณะที่ยีนของ differentiated eukaryotic cells  0.01% เท่านั้น ที่จะถูก transcribed ณ เวลาใดเวลาหนึ่ง

4 RNA synthesis (transcription)
Size RNA < DNA Largest RNA mol = 50,000 nucleotides Smallest DNA mol = 45,000,000 bp. RNA single strand (mRNA, tRNA, rRNA) snRNA scRNA snoRNA miRNA

5 RNA synthesis ต้องการ DNA template ribonucleoside triphosphate
(ATP, GTP, CTP, UTP) DNA dependent RNA polymerase Mg2+, Mn2+ ไม่ต้องการ primer

6 Transcription is initiated at promoter sites
on the DNA template กระบวนการ transcription เริ่มโดย RNA polymerase มาจับบนสายของ DNA ที่บริเวณ promoter ซึ่งเป็นตำแหน่งที่มีลำดับ nucleotide ค่อนข้างจำเพาะแน่นอน เรียกว่า consensus หรือ conserved sequence

7 ที่ promoter อาจเป็น palindrome sequence คือ nt สายหนึ่ง จะเหมือนกับ nt อีกสายหนึ่ง แต่อยู่ในทิศทางตรงกันข้าม G G A T C C C C T A G G

8 Prokaryotic promoter site DNA TTGACA TATAAT
5' -35 -10 +1 DNA TTGACA TATAAT template PRIBNOW BOX START OF RNA Eukaryotic promoter site 5' -75 -25 +1 DNA GGNCAATCT GC TATA template CAAT BOX TATABOX (HOGNESS BOX)

9

10 RNA polymerase ใน eukaryote ไม่สามารถจับบริเวณ promoter และเริ่มการสังเคราะห์ RNA ได้ด้วยตัวเอง ต้องอาศัยโปรตีนที่เรียกว่า transcription factor มาจับที่ promoter ก่อน

11 Transcription factors ของ RNA polymerase II ที่สังเคราะห์ mRNA ในคน
แบ่งเป็น 2 ประเภท TF ของ gene ที่ทำหน้าที่เหมือนกันในแต่ละ cell และทำหน้าที่ประจำในแต่ละ cell (housekeeping gene) gene เหล่านี้จะถูก transcribed ตลอดเวลา เรียกว่า constitutive genes e.g. enzyme ใน glycolysis, Krebs cycle, ETS etc. TF ของ gene ที่ทำหน้าที่จำเพาะต่อ cells, tissues gene เหล่านี้จะถูก transcribed ใน cells และ tissues บางชนิดเฉพาะเวลาที่จำเป็น และในบางเวลาของการพัฒนาการเท่านั้น

12 ตัวอย่าง Sp 1 Transcription factors interact with
eukaryotic promoters : TF I , II ตัวอย่าง Sp 1 95 Kd or 105 Kd protein from mammalian cells required for transcription of genes whose promoters contain GC boxes

13 B-protein - bind to TATA box
CTF CCAAT binding transcription factor 60 Kd bind to the CAAT Box B-protein - bind to TATA box Heat-shock transcription factor gal 4 protein : - bind กับ upstream sequence ของ promoter ของ gene ที่ encode enzyme ในการ metabolize galactose

14

15 - อาจอยู่ที่ upstream, downstream หรือ กลาง gene ที่ถูกtranscribed
นอกจาก promoter แล้ว DNA ของ eukaryotes ชั้นสูง มีส่วนที่ทำหน้าที่ควบคุม transcription ที่เรียกว่า transcription elements e.g. enhancer, silencer และ response element enhancer : - DNA sequence ที่เพิ่ม rate ของ initiation ของ transcription โดย RNA pol II - อาจอยู่ที่ upstream, downstream หรือ กลาง gene ที่ถูกtranscribed

16 silencer : DNA sequence ที่ลด หรือยับยั้ง
transcription response elements : DNA sequence สำหรับ จับกับ transcription factor ที่ถูกคุมโดย signaling molecule เช่น cyclic AMP response elements

17 + Hormonal action of glucocorticoids Inactive gene enhancer promoter
hormone-receptor complex mRNA synthesis promoter activated enhancer + active gene

18 5-ATG-TCC-GCA-CGG-CCT-3 3-TAC-AGG-CGT-GCC-GGA-5 DNA
RNA polymerase upstream sense strand (+) downstream 5-ATG-TCC-GCA-CGG-CCT-3 3-TAC-AGG-CGT-GCC-GGA-5 DNA antisense (template) strand (-) transcription RNA 5 -AUG-UCC-GCA-CGG-CCU-3 translation NH3-Met-Ser-Ala-Arg-Pro-CO2 + - Protein amino terminus carboxyl terminus

19 REMOTE RNA polymerase Prokaryotic cell มี 1 ชนิด
Eukaryotic cell มี ชนิด RNA polymerase Location Product I, A nucleolus rRNA II, B nucleoplasm mRNA III, C nucleoplasm tRNA (5S rRNA) sn RNA, sc RNA mitochondria RNAs in mito. REMOTE

20 DNA dependent RNA polymerase
form phosphodiester bond ทิศทาง 5 3 มี 6 subunits α2 ββ σω α2 ββ = core enzyme σ sigma factor

21 เมื่อ สังเคราะห์ ได้ RNA strand ยาว  10 nucleotides
σ เป็นตัวกำหนดจุดเริ่มต้นสังเคราะห์บน DNA template และจะเข้ามารวมกับ core enzyme เมื่อเริ่มต้นการสังเคราะห์ RNA เมื่อ สังเคราะห์ ได้ RNA strand ยาว  10 nucleotides ก็จะแยกจาก core enzyme α binds regulatory sequences β - forms phosphodiester bond β' - binds DNA template - recognizes promoter and initiates synthesis ω - unknown

22 DNA  first nucleotides ATP, GTP RNA synthesis 2 5'
2 (core enzyme) RNA synthesis initiation elongation termination rho factor[] release

23

24 Termination of transcription
Stem-loop structure Termination of transcription

25 Termination of transcription
RNA polymerase ppp5 Rho protein ATP + H2O ADP + H2O Termination of transcription

26 Sequences in DNA 1. unique - nonrepetitive code สำหรับ protein  2% ของ genome 2. moderately repetitive <106 copies/haploid กระจายอยู่ ใน unique sequence 3. highly repetitive bp,  copies/haploid

27 translation Coding region Intervening sequence 3 5 DNA strand
RNA transcript Poly A Cap mRNA Spliced mRNA translation Polypeptide chain H2N COOH

28 mRNA ที่สังเคราะห์จาก DNA เป็น primary transcriptเรียกว่า heterogeneous nuclear RNA (hnRNA) ต่อมาจึงมี posttranscriptional processing ก่อนผ่านออกจาก nucleus

29 Posttranscriptional processing of mRNA
poly A  200 M7 A 3 5 guanosine P P P nucleotide ตัวแรกมี base เป็น A หรือ G มี poly A (200 AMP) มาต่อทาง 3 –OH ทาง 5 –P จะมี guanosine มา capped มี methylation ที่ M7G และ M6A และ methylate ribose-2 ของ A (or G) (& อาจที่ nucleotide ตัวถัดไปด้วย) 5. ตัดส่วนที่เป็น intron ออก และเชื่อม exon เข้าด้วยกัน (splicing)

30 Posttranscriptional processing

31 Splicing ต้องอาศัยโมเลกุลของ RNA ขนาดเล็กที่อยู่ใน nucleus และ cytosol
- small nuclear RNA (snRNA) และ - small cytoplasmic RNA (scRNA) ซึ่ง RNA เหล่านี้มักจะอยู่รวมกับโปรตีนเป็น small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs, snurps) และ small cytoplasmic ribonucleoprotein particles (scRNPs, scurps)

32 snRNP (size) Role U1 (165nt) binds the 5 splice site and then the 3 splice site U2 (185nt) binds the branch site and forms part of the catalytic center U5 (116nt) binds the 3 splice site U4 (145nt) masks the catalytic activity of U6 U6 (106nt) catalyzes splicing complex U1, U2 + mRNA precursor + U4-U5-U6 complex spliceosome (60S complexes)

33 * * * * * * * * * + + + ApG 1 ApG 2 ApG AG GU AG OH 2′ 3 5 U4/6 5
exon1 intron exon2 OH 2′ * * * ApG 3 5 pGpUp pGpUpRpApYp Pre-mRNA ApG U1 1 U2 U5 pGpUp U4/6 3′splice site 5′splice site Intron exon2 exon1 (2,5) 5 * * * ApG OH 3′ + pGpUpRpApYp ApG 3 2 spliced junction pGpUp exon1 exon2 (2,5) + 5 * * * ApG 3 pGpUpRpApYp ApG OH 3′ + excised intron in lariat form spliced exons Complex U1 ,U2 + mRNA precursor + U4 –U6-U5 complex Spliceosome (60s complex)

34 Splice sites in mRNA precursor are specified by sequences at
the end of introns. Branch site 5 AGGUAAGU A CAGG 3 intron Splicing : snRNPs ATP spliceosome SLE : systemic lupus erythematosus results from autoimmune response in which patients produces Ab against snRNPs

35 Segment 3 deleted by Alternative Splicing
hn RNA 1 2 3 4 5 Constitutive Splicing All splice sites used AAAAAAA 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 AAAAAA 1 2 4 5 Segment 3 deleted by Alternative Splicing

36 Poly A addition signals
b hn RNA 1 2 3 4 5 Poly A addition signals AAAAAA Site a used 1 2 3 4 AAAAAA Site b used 1 2 3 4 5 Alternative tailing

37 Aberrant splicing Thalassemia บางชนิด mutation G A (19nt away from normal 3 splice site of first intron) new 3 acceptor site (splice site) Aberrant protein

38 Normal -thal Normal 3 end of intron
5 CCTATTGGTCTATTTTCCACCGTTAGGCTGCTG 3 -thal 5 CCTATTAGTCTATTTTCCACCGTTAGGCTGCTG 3

39 Posttranscriptional RNA editing
e.g. apolipoprotein B mRNA editing protein human plasma : apo B 2 isoproteins apo B 100, apo B 48 synthesized from a single gene by mRNA editing mechanism

40 apo B100 in liver is translated from a full-length
14.1 kb mRNA apo B 48 in intestine is synthesized from an apo B mRNA containing premature inframe translational stop codon CAA UAA

41 Posttranscriptional RNA editing
Lipoprotein assembly LDL receptor binding 4536 512kd 1 Apo B 100 Translation 5 3 CAA Unedited mRNA RNA editing by deamination NH4 5 UAA 3 Edited mRNA Translation 2152 240 kd 1 Apo B 48

42 rRNA in eukaryotic cell
5S ได้จาก 5S rRNA precursor S, 18S, 28S ได้จาก 45S rRNA precursor 5S rRNA precursor 3 5 121 nucleotides 45S rRNA precursor 18S 5.8S 28S

43 Prokaryotic ribosome Eukaryotic ribosome 70S 80S 23 S RNA 5S RNA
~34 proteins 50S 16 S RNA 70S ~21 proteins 30S Eukaryotic ribosome 28S RNA 5.8S RNA 5S RNA ~50 proteins 60S 18S RNA 80S ~30 proteins 40S

44 26S rRNA precursor from Tetrahymena
Self-splicing RNA : The discovery of catalytic RNA Thomas Cech 26S rRNA precursor from Tetrahymena 5 self splicing spliced exon 5 5' G exon G 3 OH OH intron G + exon G 3 3 OH 5 5 catalytically active L19 RNA 3 3 L-19 IVS – nuclease and polymerase

45 มี modified base เช่น methylation, deamination
t RNA RNA ที่มีอณูเล็กที่สุด 4S (73-93 nucleotides) มี 50+ ชนิด (for 20 aâ) tRNA ที่ทำหน้าที่จับกับ amino acid ชนิดเดียวกันเรียกว่า isoaccepting tRNA มี modified base เช่น methylation, deamination 5 3 ribonuclease P exonuclease 5 G C-C-A 3 3 5 A G C C CTP, CTP, ATP anticodon จับกับ codon บน mRNA

46

47 สารที่ยับยั้ง RNA synthesis
รวมกับ DNA template ยับยั้ง RNA polymerase 1. รวมกับ DNA template 1.1 Intercalation Actinomycin D (between 2G-C base pairs) inhibit transcription > replication : daunomycin, doxorubicin, mithramycin, ethidium bromide Cross-link Alkylating agents – nitrogen mustard, mechoethamine etc. form cross link ระหว่าง 2 guanines (N7) ที่อยู่คนละสาย

48 2. ยับยั้ง RNA polymerase
2.1 Rifamycin, rifampicin inhibit RNA polymerase (initiation) ของ prokaryote, inhibit only mitochondrial RNA polymerase ของ eukaryote 2.2 -Amanitin Amanita phalloides inhibit mammalian nuclear RNA polymerase II 2.3 Streptolydigin inhibit RNA elongation