การวางแผนการทดลองทางสัตว์

งานนำเสนอเรื่อง: "การวางแผนการทดลองทางสัตว์"— ใบสำเนางานนำเสนอ:

1 การวางแผนการทดลองทางสัตว์
รศ.ดร.มนต์ชัย ดวงจินดา ภาควิชาสัตวศาสตร์ คณะเกษตรศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น

2 Contents Planning Experiments Basic Experimental Design
Frequently asked question Some useful technique for treatment analysis Example and SAS usage Specific question for different species

3 ทำไมต้องทำการทดลอง? ตอบข้อสงสัย
ขยายขอบเขตทางวิชาการ ค้นหาวิธีการใหม่ ปรับวิธีการเก่าหรือทดสอบหรือเปรียบเทียบกับสิ่งใหม่ พิสูจน์ทฤษฏี เพื่อยืนยันหรือล้มล้าง

4 STEPS IN PLANNING EXPERIMENT
กำหนดปัญหา รวบรวมข้อมูล ตั้งวัตถุประสงค์ จัดเตรียมข้อมูล ค้นคว้าเอกสาร ทำการทดลอง วิเคราะห์ทางสถิติ กำหนดทรีทเมนต์ แปลผล กำหนดขนาดงานทดลอง เขียนรายงาน เลือกแผนการทดลอง นำใช้

5 ทำไมต้องวางแผน ? Ex งานทดลองหนึ่งผู้วิจัยต้องการทดสอบสารออกฤทธิ์ ขับปัสสาวะ 2 ชนิดในสุนัข ดังนี้ ค่าเฉลี่ย =250 =100 =160 เพศ พันธุ์ อายุ สาร ปัสสาวะ D 10 F 260 B 30 F 235 T 100 P 115 D 7 C 130 T 120 C 200 B 80 P 80 F: Furasimide P: เหง้าสับปะรด C: Control D=dulmation, B=boxer, T=Thai

6 ความสำคัญของการวางแผนการทดลอง
หลีกเลี่ยงอิทธิพลพัวพัน เพื่อการสรุปผลที่แม่นยำ น่าเชื่อถือ เพื่อสะดวกในการจัดการ ทำให้สามารถเข้าใจเป็นสากล เป็นการสร้างงานทดลองที่มีคุณภาพและมีมาตรฐาน

7 องค์ประกอบหลักของงานทดลอง
หน่วยทดลอง (Experimental units) ทรีทเมนต์ (Treatments) ซ้ำ (Replications) การสุ่ม (Randomization) การควบคุมความคลาดเคลื่อนงานทดลอง (Control of Experimental Error)

8 อัตราการเต้นของหัวใจ ทรีทเมนต์ ชนิดยา
แบบเดี่ยว ค่าสังเกต อื่น ๆ ….. อัตราการหายใจ อัตราการเต้นของหัวใจ ทรีทเมนต์ ชนิดยา หน่วยทดลอง ค่าสังเกต อื่น ๆ ….. FCR ADG ทรีทเมนต์ สูตรอาหาร A,B,C แบบกลุ่ม

9 ประเภทของทรีทเมนต์ 1) ทรีทเมนต์คุณภาพ (Qualitative Treatment) - รูปแบบวิธีการ สูตรอาหาร สายพันธุ์จุลินทรีย์ สารเคมีชนิดต่างๆ 2) ทรีทเมนต์ปริมาณ (Quantitative Treatment) - ระดับยาปฏิชีวนะในสูตรอาหาร, อัตราเร็วของการให้น้ำเกลือ, ระยะเวลาในการเก็นน้ำเชื้อแช่แข็ง

10 การวิเคราะห์ค่าเฉลี่ยทรีทเมนต์
Multiple comparisons Orthogonal contrasts Orthogonal polynomials

11 Multiple Comparisons การเปรียบเทียบค่าเฉลี่ยแบบเป็นคู่
ไม่ควรใช้ หาก F-test จาก ANOVA ไม่พบนัยสำคัญ ตัวทดสอบแต่ละตัวให้ผลการทดสอบแตกต่างกันได้ LSD DUNCAN SNK TUKEY SCHEFFE Smallest Critical Value Highest Easy to Significant Easy to Non-Sig

12 Orthogonal Contrast ใช้ในกรณีที่ทรีทเมนต์สามารถจัดเป็นกลุ่มในการ เปรียบเทียบได้ เป็น Pre-Plan comparisons โดยใช้ตัวสถิติ F เป็นตัวทดสอบ ใน SAS ใช้ PROC GLM

13 Example การเปรียบเทียบอาหารโคนม 4 สูตร T1 = 16% CP (control)
T2 = 16% CP + Monensin T3 = 16% CP + Virginiamycin T4 = 16% CP + Yeast T1 T2 T3 T4 T1 Vs T2,T3,T4 +3 -1 T2,T3 VS T4 +2 T2 Vs T3 +1

14 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F
PERIOD TRT ** Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value Pr > F T1 VS T2,T3,T T3 VS T2,T ** T2 VS T **

15 Orthogonal Polynomials
ใช้ในกรณีที่ทรีทเมนต์เป็นค่าตัวเลขแสดงปริมาณ การเปรียบเทียบค่าเฉลี่ยแบบเป็นคู่ ไม่สามารถสรุปแนวโน้มการตอบสนอง (trend) ได้ ใน SAS ใช้ PROC GLM

16 Example การทดสอบการใช้ฮอร์โมน GnRH ต่อขนาดรังไข่ปลานิล T1 = 0 IU
10 20 30 นน.รังไข่

17 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F
GNRH ** Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value Pr > F Linear ** Quadratic ** Cubic

18 ลักษณะการจัดทรีทเมนต์
1) Single factor การศึกษาเพียงปัจจัยเดียวในการทดลอง การใช้ embryo MEDIA TCM199 Whittingham H&P ปัจจัย (Factor) T1 T T3 การลด Aflatoxin Propronate ผึ่งแดด Control การใช้ antibiotic Streptomycin Oxytocin Tylosin การใช้วัคซีน rec-Vac con-Vac Control

19 กากถั่วเหลือง ปลาป่น 0% 2% 4% (a1) (a2) (b1) (b2) (b3)
2) Multifactor การศึกษาหลายปัจจัยร่วมกันในการทดลอง treatment ที่จะใช้จึงเป็น combination ของทุกปัจจัย 0% % % (b1) (b2) (b3) การเสริมไขมัน (Factor B) กากถั่วเหลือง ปลาป่น (a1) (a2) แหล่งโปรตีน (Factor A)

20 Treatment Combination
SB=กากถั่วเหลือง FM=ปลาป่น Factor A Factor B Treatment a1 b1 a1b1 = T1 SB+ 0% FAT b2 a1b2 = T2 SB+ 2% FAT b3 a1b3 = T3 SB+ 4% FAT a2 b1 a2b1 = T4 FM+ 0% FAT b2 a2b2 = T5 FM+ 2% FAT b3 a2b3 = T6 FM+ 4% FAT

21 การอ่านผล factorial experiments
Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F PROT ** FAT PROT*FAT ** Interaction significant ต้องแปลผลแยก เปรียบเทียบผลการเสริมไขมันแยกในแต่ละแหล่งโปรตีน %Fat SB FM

22 Replications ความสำคัญของ replication ประเมิน MSE
– หากไม่มี rep , DF error = 0 เพิ่ม precision ให้กับค่าเฉลี่ยทรีทเมนต์ – การเพิ่ม rep ช่วยทำให้ค่า SEM ลดลง ค่าเฉลี่ยที่ได้มีความ ถูกต้องมากขึ้น ช่วยควบคุมความคลาดเคลื่อนงานทดลอง – ในกรณีที่เพิ่ม block จะช่วยลด MS(block) ออกจาก MSE เพิ่ม power of test – เพิ่มประสิทธิภาพการทดสอบ

23 การประเมิน Replications 1
Steel &Terri ต้องการ DF error > 9

24 การประเมิน Replications 2
Starting step กำหนดค่า CV และ DF(ERR) เริ่มต้นสำหรับ t-alpha และ t-power of test CV = coefficient of variation  = ความแตกต่างที่ต้องการ detect ได้ (% of mean 1-  = power of test  = ระดับนัยสำคัญ Iterative step นำค่าซ้ำที่ได้มาประเมินค่า DF(ERR) จากนั้นคำนวณซ้ำอีกครั้ง ทำจนกระทั่งได้ค่าซ้ำคงที่

25 EX ต้องการสร้างงานทดลอง CRD 4 ทรีทเมนต์ กำหนดลักษณะมี Cv=10%, ต้องการทดสอบพบความแตกต่างหาก ความแตกต่างมากกวา 20% Step1: ลองกำหนด DF(Err) = 9, t.025(9) = 2.69, t.80(9) = 0.261 Step 2: DF(Err) = t(r-1) = 4*(5-1) = 16, t.025(16) = 2.47, t.80(16) = 0.256

26 EX (‘Cont) Step 2: DF(Err) = t(r-1) = 4*(4-1) = 12, t.025(12) = 2.59, t.80(12) = 0.259 สรุปต้องใช้ rep เท่ากับ 4

27 Basic Experimental Design
Group t-TEST Paired t-TEST Two Groups Continuous Trial Equal or Greater than Two Groups CRD, RCBD ANOVA Cross-over Trial Simple Cross-over, Latin Square Repeated Measurement Trial Split-plot in Time

28 t-TEST ใช้กับการเปรียบเทียบ 2 ทรีทเมนต์ การเลือกใช้ให้สังเกตว่า:
Unrelated treatments => group t-TEST Related treatments => paired t-TEST การเลือกใช้ให้สังเกตว่า: 2 ทรีทเมนต์ ที่ศึกษาเป็นอิสระต่อกันหรือมีความสัมพันธ์กัน

29 E.U. = 10 TRT = 2 (T1 = Drug1, T2 = Drug2) T1 T2 Rep = 5 ตัว/TRT T1 T2 Group t-TEST Drug1 และ Drug2 อิสระต่อกัน

30 E.U. = 5 TRT = 2 (T1 = Normal, T2 = Stress) Rep = 5 ค่าสังเกต/TRT ทำให้เครียด T1 สภาพปกติ T2 สภาพเครียด Paired t-TEST ค่าสังเกตจาก T1 และ T2 มาจากหน่วยทดลองเดียวกัน

31 CRD แผนงานทดลองแบบสุ่มสมบูรณ์ (Completely Randomized Design)
ใช้กับการเปรียบเทียบตั้งแต่ 2 ทรีทเมนต์ขึ้นไป หน่วยทดลองหรือสัตว์มีความสม่ำเสมอกัน จัดทรีทเมนต์ให้กับหน่วยทดลองอย่างสุ่ม

32 E.U. = 9 TRT = 3 (T1 = สูตร1, T2 = สูตร2, T3 = สูตร3) Rep = 3 ตัว/TRT T1 T2 T3 CRD T3 T1 T2 สูตร1, สูตร2 และ สูตร3 อิสระต่อกัน

33 MODEL: Yij = µ + Ti + Eij SOV DF TRT t-1 ERR t(r-1) TOTAL tr-1

34 RCBD แผนงานทดลองแบบบล็อกสมบูรณ์ (Randomized Complete Block Design)
ใช้กับการเปรียบเทียบตั้งแต่ 2 ทรีทเมนต์ขึ้นไป สัตว์ที่ใช้สามารถแยกปัจจัยผันแปรได้ 1 อย่างที่สามารถจัดเป็นกลุ่มได้ก่อนให้ทรีทเมนต์ หน่วยทดลองต้องมีความสม่ำเสมอภายในบล็อก จัดทรีทเมนต์ให้กับหน่วยทดลองอย่างสุ่มภายในแต่ละบล็อก

35 E.U. = 9 TRT = 3 (T1 = Drug1, T2 = Drug2, T3 = Drug3) RCBD T1 T3 T2 T1 T2 T3 T2 T3 T1 Drug1, Drug2 และ Drug 3 ถูกสุ่มภายในแต่ละบล็อก

36 MODEL: Yij = µ + BKi + Tj + Eij
SOV DF BLOCK b-1 TRT t-1 ERR (t-1)(b-1) TOTAL tb-1

37 Simple Cross-over Design
แผนงานทดลองแบบเปลี่ยนสลับอย่างง่าย ใช้กับการเปรียบเทียบ2 ทรีทเมนต์ สัตว์แต่ละตัวจะได้รับทั้ง 2 ทรีทเมนต์ โดยมีการเปลี่ยนสลับใน period ถัดไป ดังนั้นจึงใช้เวลา 2 period

38 E.U. = 6 TRT = 2 (T1 = Feed1, T2 = Feed2) Period 1 T1 T2 Period 2 Simple Cross-over T1 T2 ค่าสังเกตจาก T1 และ T2 มาจากหน่วยทดลองเดียวกัน

39 Split-Plot Design แผนงานทดลองแบบสปลิทพลอท (Split plot Design)
มี 2 ปัจจัย แต่มีการสุ่มทีละปัจจัยให้กับหน่วยทดลอง

40 E.U.(Main plot) = 9 A = 3 (A1 = สูตร1, A2 = สูตร2, A3 = สูตร3) A1 A2 A3 Split-Plot Main plot CRD Subplot B = 2 (B1,B2) A3 A1 A2 B1 B2 B2 B1 A1 B1 B2 B2 B1 A3 B2 B1 B1 B2 A2

41 MODEL: Yijk = µ + Ai + Err(a) +Bj + ABij + Eijk
SOV DF A a-1 ERR(a) a(r-1) B b-1 AB (a-1)(b-1) ERR(b) ab*(r-1) TOTAL abk-1

42 Repeated Measurement Design
แผนงานทดลองที่มีการวัดซ้า เป็นการวางแผนแบบ CRD หรือ RCBD ตามปกติ แต่มีวัดค่าสังเกตซ้ำเป็นระยะ เช่น ทุกสัปดาห์ ทุกเดือน ฯลฯ ใช้ข้อมูลทั้งหมดในการวิเคราะห์ ทำให้ทราบเพิ่มถึงการตอบสนองของแต่ละทรีทเมนต์เมื่อเวลาเปลี่ยนไป

43 T1 T1 T2 T2 Repeated Measurement WK1 WK2 WK3 WK4

44 Repeated measurement analysis
Spherecity test for correlated error YES NO Multivariate Technique Wilk’s lambda statistics Split-plot in time Pseudo F adjusted by G-G or H-F method Regular Split-plot in time

45 T1 T2 Repeated Measurement WK1 WK2 WK3 WK4

46 Other Statistical Analysis in Animal Research
Simple reg. Multiple reg. Regression Prediction Non-linear model, Time series model Chi-square Logistics model Categorical Data analysis Censor data Probit analysis Survival analysis Cluster analysis, discriminant etc.

47