Introductory Biochemistry (1/ 2552)

งานนำเสนอเรื่อง: "Introductory Biochemistry (1/ 2552)"— ใบสำเนางานนำเสนอ:

1 211315 Introductory Biochemistry (1/ 2552)
Introduction to the biochemistry of life Principle methods of biochemistry Chemistry & metabolism of carbohydrates Electron transport & bioenergetics ดร. นพกาญจน์ จันทร์เดช 5. Chemistry and metabolism of lipids 6. Enzymes and coenzymes 7. Applied biochemistry 8. Chemistry & metabolism of amino acids and proteins 9. Chemistry & metabolism of nucleic acids รศ. ดร. เกรียงศักดิ์ ไชยโรจน์ ผศ. ดร. หทัยชนก เนียมทรัพย์

2 หนังสืออ่านประกอบ 1) ชีวเคมีทั่วไป
1) ชีวเคมีทั่วไป 2) Biochemistry: the chemistry of life (International Edition). David T. Plummer 3) Harper’s Biochemistry (25th-edition). Robert K. Murray, Daryl K. Granner, Peter A. Mayes, and Victor W. Rodwell 4) General, Organic and Biochemistry (4th-edition). Denniston, K.J., Topping, J.J., and Caret, R.L.

3 เข้าใจหลักการและวิธีการตรวจวัดขั้นพื้นฐานทางชีวเคมี
OBJECTIVES เข้าใจหลักการและวิธีการตรวจวัดขั้นพื้นฐานทางชีวเคมี ชนิด และลักษณะสำคัญของ carbohydrates Metabolism ของ carbohydrate ชนิดต่างๆ ในสิ่งมีชีวิตชนิดต่างๆ กลไกการถ่ายทอดอิเลคตรอนในสิ่งมีชีวิต และพลังงานในสิ่งมีชีวิต

4 1) Introduction to Biochemistry of Life
What is biochemistry? Categories of biochemistry Chemical materials of life = Biomolecules; carbohydrate (sugar and polysaccharides, protein (amino acid and enzymes), lipid, nucleic acid Reaction of biomolecules = Metabolism (anabolism and catabolism) 3) Metabolic regulation

5 Metabolism (metabolism)
protein, carbohydrate, lipid, enzyme, nucleic acid glucose, amino acid C H O N [S] Macromolecules Molecules atom Metabolism (metabolism) Catabolism NADH or NADPH Micro molecules Lactic acid Pyruvic acid CO2 , NH3 Urae Macro molecules Carbohydrate Polysaccharides  sugar Protein Lipid Oxidative phosphorelation Reducing equivalence Energy O2 H2O Anabolism

6 Metabolic Pathway (metabolic pathway)
Catabolic pathway: การหายใจของเซลล์; สร้างพลังงาน (ATP และ NADPH) Aerobic respiration ได้แก่ Electron transport chain Oxidative phosphorylation Anaerobic respiration ได้แก่ Cori cycle Lactic acid fermentation Ethanol fermentation Glycogenolysis; สลายแป้ง (แป้งในสัตว์)/ไกลโคเจน  กลูโคส - Glycolysis; กลูโคส  ไพรูเวต (pyruvate) และ ATP - Entner-Doudoroff Pathway; alternative-glycolysis ในแบคทีเรีย - Pentose phosphate pathway (hexose monophosphate shunt); สร้าง NADPH จากกลูโคส Protein catabolism; protein  amino acid

7 Anabolic pathway; เป็นกระบวนการสร้างโมเลกุลของสารที่ซับซ้อน จากสารประกอบตั้งต้นอย่างง่าย: - Glycogenesis: การสังเคราะห์ไกลโคเจน - Gluconeogenesis: การสังเคราะห์กลูโคส - Secondary metabolism; กระบวนการสร้างสารที่ไม่สำคัญต่อการเจริญเติบโต แต่มีความสำคัญต่อการดำรงชีวิต - การสังเคราะห์แสง (Photosynthesis) ปฏิกิริยาที่ขึ้นกับแสง (light reaction) ปฏิกิริยาที่ไม่ขึ้นกับแสง (dark reaction)

8 Prokaryotic cells: the simplest forms of life

9 ในเซลล์แบคทีเรียมี Mitochondria !! DNA Nucleus Prokaryotic cell
Eukaryotic cell DNA Nucleus ในเซลล์แบคทีเรียมี Mitochondria !! Anatomy of the bacterial cell

10 ลักษณะสำคัญของ Prokaryotic cell (page2-3)
1 ไม่มีเยื่อหุ้มนิวเคลียส 2. เยื่อหุ้มเซลล์มีหน้าที่หลายอย่าง ลักษณะสำคัญของ Eukaryotic cell มีเยื่อหุ้มนิวเคลียส มีcytoskeleton; microtubules & microfilaments มี exocytosis & endocytosis มีการแบ่งเซลล์แบบ mitosis & miosis ลักษณะพื้นฐานที่เหมือนกัน มีเยื่อหุ้มเซลล์ มีDNA เป็นสารพันธุกรรม มีเอนไซม์ควบคุม มีRNA เป็นตัวถ่ายทอดคำสั่งจาก DNA สังเคราะห์โปรตีนที่ไรโบโซม 6. ใช้ ATP เป็นแหล่งพลังงานเบื้องต้น

11 Cell wall (ไม่มีในเซลล์สัตว์; เกิด plasmolysis)
Protoplasm cytoplasm nucleus Cell wall (ไม่มีในเซลล์สัตว์; เกิด plasmolysis) Cell membrane (semipermeable membrane) Organelles Endoplasmic Recticulum (ER) RER (สังเคราะห์โปรตีน) & SER (สลายไกลโคเจน) Lysosome (มีเฉพาะในเซลล์สัตว์) Ribosome (สังเคราะห์โปรตีน) Mitochondria** Plastid (ไม่พบในรา แบคทีเรีย cyanobacteria) leucoplast (สะสมอาหาร) chromoplast (รงควัตถุ) chloroplast (รงควัตถุสีเขียว) grana stroma Vacuole sap vaculoe/ food vacuole/ pinocytotic vacuole/ contractile vacuole/ nucleolar vacuole/ gas vacuole centriole L

12 2) Principle Methods of Biochemistry
2.1 sample preparation: (p-8) Breaking up cells/ tissue Homogenization Centrifugation 2.2 separation methods: (p-9-14) Chromatography paper and thin layer chromatography column chromatography Ion exchange chromatography gel filtration HPLC gas chromatography Electrophoresis analytical methods: (p-15)

13 แยกน้ำเลี้ยงกับ cell ออกจากกันได้ นำของเหลวภายใน cell ไปวิเคราะห์ **
2.1 Sample preparation Osmotic pressure Freeze & thaw Sonication centrifugation แยกน้ำเลี้ยงกับ cell ออกจากกันได้ Cell lysis นำของเหลวภายใน cell ไปวิเคราะห์ ** ชนิด, ปริมาณ, ทำให้บริสุทธิ์

14 g = (1.118 × 10-5) R S2 Centrifugation:
 “centrifugal force” เป็นแรงเหวี่ยงที่ทำให้อนุภาคหนีออกจากจุดศูนย์กลาง  ระดับของ centrifugal force ขึ้นกับขนาดของอนุภาค  macromolecule จะเคลื่อนออกจากจุดศูนย์กลางได้เร็วกว่า micromolecule  หน่วยของความเร็วในการ centrifuge: times gravity (×g) หรือ centrifugation rotor speed; revolution per minute (rpm) g = (1.118 × 10-5) R S2 g = times gravity R = รัศมีของหัวเหวี่ยง (cm) S = speed of the centrifuge in rpm (revolution per minute) Example, centrifugation of a sample at 5,000 rpm in a microcentrifuge that has a rotor with a radius of 7 cm will deliver a centrifugal force of 1,957 × g

15 Types of rotor 1. Fixed angle rotors (14-40ﾟ, usually 30ﾟ) 2. Swing-out rotors (used for pelleting small quantities of materials) 3. Vertical rotors 4. Continuous flow rotors (for cell harvesting)

16 Fractional centrifugation
10 min, 600xg 10 min, 10,000xg 180 min, 100,000xg Cell debris (เศษเซลล์) Organelles Ribosome

17 Separation & Purification
a) Chromatography หลักการ สารต่างชนิดกันมีความสามารถในการละลายใน mobile phase และละลายใน Stationary phase ต่างกัน Paper chromatography Stationary phase = น้ำในกระดาษกรอง Mobile phase = solvent or buffer (ที่มีขั้วน้อยกว่าน้ำ) การแยกของสารผสมที่มีสี สามารถมองเห็นได้ด้วยตาเปล่า กรณีสารผสม เป็นสารไม่มีสี -Thin layer material + fluorescent indicator ; UV-detectable -Compound  Color reaction Ex. unsaturated compound :: Iodine vapour amino acid :: Ninhydrin reagent reducing sugar:: Dinitrosalicylic acid, Benedict’s solution

18 Rf = ระยะที่สารเคลื่อนที่ (cm) ระยะที่ตัวทำละลาย(ตัวชะ)เคลื่อนที่ (cm)
Rf value depends on the nature of the thin layer material, and the composition of the solvent Fig. Schematic of TLC Thin layer plate Solvent Filter paper Sample Solvent front Fig. Separation by TLC

19 - Column chromatography

20 - Column chromatography
ตัวชะ (eluent) ตัวกลาง (stationary phase) หลักการ eluent จะเป็นตัวพาสารผสมออกจาก column ทางด้านล่างด้วยความเร็วต่างๆกัน ประสิทธิภาพของ column chromatography ขึ้นอยู่กับชนิดของสารตัวอย่าง, การเลือกใช้ตัวกลาง และขนาดของ column

21 Ion-exchange chromatography
- สารตัวกลางเป็นสารที่มีประจุ เช่น carboxymethylcellulose ซึ่งเป็น cellulose ที่มี carboxymethyl group (-CH2COO-) หรือ polystylene ที่มี aminomethyl group (-CH2NH3+) - สารตัวกลาง = resin หรือ exchanger หรือ matrix - ประจุในตัวกลางทำหน้าที่ยึดสารที่มีประจุตรงข้ามไว้ anion exchange chromatography ; สารตัวกลางมีประจุบวก (แลกเปลี่ยนประจุลบ) เช่น diethylaminoethyl- ;DEAE -O-C2H5-NH-C2H5 C2H5 cation exchange chromatography ; สารตัวกลางมีประจุลบ (แลกเปลี่ยนประจุบวก) เช่น carboxymethyl- ; CM O-CH2-COO-

22 Cellulose กำหนดให้ตัวชะ คือ KCl K+ Samples ; KCl Cl- A-
CM-Cellulose OCH2COO- Cellulose Cation exchanger กำหนดให้ตัวชะ คือ KCl K+ Samples ; KCl Cl- A- B+ (ความเข้มข้นต่ำ)**

23 pH gradients Protein Detection: Abs 280 nm
ตัวอย่าง: การชะโปรตีนผสมออกจาก column 1. pH gradients 2. Ionic strength gradient ** pH gradients Decrease pH of buffer for anion-exchange chromatography (ประจุลบ กลายเป็นกลาง) Increase pH of buffer for cation-exchange chromatography (ประจุบวกกลายเป็นกลาง) pH 7.0 pH 6.0 pH 5.0 Phenylalanine Protein#1 Protein#2 Protein#3 Protein Detection: Abs 280 nm Anion-exchange chromatography (target protein = negative)

24 Ionic strength gradients
ตัวอย่าง: การชะโปรตีนผสมออกจาก column 1. pH gradients 2. Ionic strength gradient ** Ionic strength gradients KCl (low conc. 10 mM) KCl (0.5M) KCl (1.0M) Prot1 (+++) Prot2 (++) Prot3 (+) Prot4 (-) Prot1 (+++) Prot2 (++) Prot1 (+++) Prot3 (+) Prot4 (-) Prot2 (++) Cation-exchange chromatography (target protein = negative)

25 A280 nm Prot2 (++) [KCl] M 2.0 Prot1 (+++) Prot3 (+) & prot4 (-) 1.5 1.0 0.5 Fraction no.

26 - Gel filtration - แยกสารต่างๆได้ตามขนาดโมเลกุลของสาร - ตัวกลางคือ polysaccharide เช่น sephadex, sepharose, agarose เป็นต้น - ตัวกลางมีคุณสมบัติยอมให้โมเลกุลขนาดเล็กลอดผ่านเข้าไปได้ - เมื่อชะสารต่างๆออกจาก column สารที่มีโมเลกุลเล็กจะเคลื่อนที่ออกจาก column ได้ช้า - พิจารณาขนาดโมเลกุลของสารตัวอย่าง, ชนิดของตัวกลาง และความยาวของ column

27 Gas chromatography (GC)
-ใช้แยกสารพวก volatile non-polar substances โดยเปลี่ยนสารผสมให้เป็นไอที่อุณหภูมิหนึ่ง แล้วผ่านไอไปสู่ column - stationary phase = gas or liquid (gas-liquid chromatography) ถ้า stationary phase เป็นพวก non-polar จะเสถียรที่ช่วงอุณหภูมิกว้าง - mobile phase = gas เช่น Nitrogen, Helium, Hydrogen การวิเคราะห์ sample injection สารผสมจะถูกให้ความร้อนจนกลายเป็นไอแล้วถูกพาเข้าไปใน column ตรวจวัดโดย detector และแสดงออกมาในรูปของ chromatogram

28 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
- Stationary phase: ของเหลวที่เคลือบอยู่บนสารยึดซึ่งเป็นของแข็งบรรจุใน column ขนาดเล็ก Sample จะถูกฉีดผ่าน injector และอาศัยแรงดันจากปั๊มช่วยนำตัวทำละลาย (mobile phase) ออกจาก reservoir พา sample ผ่าน column - ระยะเวลาที่sample ผ่านเข้าออก column เรียกว่า retention time ในสภาวะเดียวกัน สารชนิดเดียวกันจะมี retention time เท่ากัน สามารถหาชนิดของสารตัวอย่างได้จากการเปรียบเทียบ retention time กับสารมาตรฐาน สามารถหาปริมาณของสารตัวอย่างได้จากการคำนวณพื้นที่ใต้peak เทียบกับสารมาตรฐานที่ทราบชนิด และปริมาณ

29 ตัวอย่าง Standard glucose 10 mM Standard fructose 10 mM
Standard sucrose 10 mM

30

31 การหาปริมาณกลูโคสในสารตัวอย่าง
Detection signal Glucose 100 mM Glucose 10 mM Glucose 1 mM Retention time พื้นที่ใต้กราฟ glucose (unit 2) 1 10 100 ความเข้มข้น glucose (mM)

32 - ตัวกลาง = กระดาษกรอง(with buffer)
b) Electrophoresis เป็นการแยกสารโดยอาศัยกระแสไฟฟ้า หลักการ อนุภาคที่มีประจุไฟฟ้าจะเคลื่อนที่ไปในสนามไฟฟ้า อนุภาคที่มีประจุบวกจะ เคลื่อนที่ทวนทิศทางของสนาม ส่วนอนุภาคประจุลบจะเคลื่อนที่ตามทิศทางของสนาม macromolecule ที่มีหมู่ -NH3+, -COO-, หรือ -PO32- จะมีประจุบนโมเลกุล ทิศทางกระแสไฟฟ้า - ตัวกลาง = กระดาษกรอง(with buffer) - เหมาะสำหรับวิเคราะห์สารโมเลกุลเล็ก -หลังจากผ่านกระแสไฟฟ้าแล้ว นำกระดาษไปผึ่งให้แห้ง - ถ้าสารที่แยกได้ไม่มีสีอาจตรวจดูได้โดยการย้อมสี หรือทำปฏิกิริยาให้เกิดสี เช่น ถ้าเป็นกรดอะมิโน อาจพ่นด้วยนินไฮดริน แล้วทำให้ร้อน จะเกิดสีน้ำเงิน

33 Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)
ตัวกลาง = polymer ของสาร acrylamide และ N,N’-methylene-bis-acrylamide -เจลมีลักษณะพิเศษคือ เส้นpolymer มีลักษณะเป็นตาข่าย ดังนั้นจึงสามารถกั้นโมเลกุลขนาดใหญ่ให้ เคลื่อนที่ช้าลงได้ ดังนั้นอัตราการเคลื่อนที่ของสารจึงถูกกำหนดด้วยประจุ และขนาดโมเลกุล -ในกรณีที่มี sodium dodesylsulfate (SDS) ซึ่งเป็นผงซักฟอกอยู่ในระบบจะทำให้สารละลาย โปรตีนที่ต้องการแยกเสียสภาพ และมีประจุต่อหน่วยมวลใกล้เคียงกัน (all negative) ดังนั้น การแยกโปรตีนด้วยวิธี SDS-PAGE จะแยกสารออกจากกันโดยอาศัยขนาดโมเลกุลเท่านั้น - สามารถใช้ SDS-PAGE หาน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนได้

34 การทำงานของ SDS-PAGE

35 Polyacrylamide gel electrophoresis
Tris buffer pH 9.0

36 ต่างๆกัน เรียกว่า spectrum
c) Spectroscopy คือการวัดปริมาณรังสีแม่เหล็กไฟฟ้า ที่สารหนึ่งสามารถดูดซับเอาไว้ได้เมื่อมี รังสีฉายผ่านสารนั้น รังสีแม่เหล็กไฟฟ้า อาจมีความยาวคลื่น (wavelength) ได้ ต่างๆกัน เรียกว่า spectrum - สารต่างชนิดกันมีความสามารถในการดูดซับรังสีที่ความยาวคลื่นต่างกัน - สารชนิดเดียวกัน ความเข้มข้นหรือปริมาณต่างกัน ดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นเดียวกันได้ไม่เท่ากัน - หน่วยความยาวคลื่น คือ นาโนเมตร (nm) - UV light: 185 – 400 nm Visible light: nm

37 เครื่องมือและหลักการที่ใช้ใน spectroscopy
spectrophotometer หรือ spectrometer คือเครื่องมือที่ใช้วัดการดูดกลืนรังสี แม่เหล็กไฟฟ้าของสาร ประกอบด้วย แหล่งของรังสี และส่วนที่ใช้เลือก ความยาวคลื่น (monochrometer) รังสีจากแหล่งจะผ่าน monochrometerไปยังสารละลาย ซึ่งจะดูดเอาไว้ส่วนหนึ่ง รังสีส่วนที่ทะลุออกมาสามารถวัดได้ด้วย detector

38 กฎของเบียร์-แลมเบิร์ต
ความเข้มของรังสีที่มาตกกระทบ (I0) จะลดลงเป็น I เมื่อผ่านสารละลายเป็นระยะทางdx “ ความเข้มของรังสีที่ถูกดูดเอาไว้ (dI) จะแปรเป็นสัดส่วนโดยตรงกับความเข้มข้น (c) และระยะทางที่รังสีนั้นวิ่งผ่านสารละลาย (dx)” ʃ dI = ʃ k’cdx ; k’ = ค่าคงที่ I ---- ถ้า conc. มาก อัตราส่วนระหว่าง dI/I มาก ---- ---- ถ้า dx มาก อัตราส่วนระหว่าง dI/I มาก ---- I d dx I0 I I0

39 log (Io/I) = optical density (OD) หรือ absorbance (A) ของสารละลาย
ดังนั้น ถ้าให้รังสีความเข้มข้น I0 วิ่งผ่านสารละลายเป็นระยะทาง dx จะได้ log (Io/I) = kcdx log (Io/I) = optical density (OD) หรือ absorbance (A) ของสารละลาย k (เท่ากับ k’.ln10 ซึ่งเรียกว่า extinction coefficient จะมีค่าคงที่เมื่อความยาวคลื่นคงที่ และเป็นค่าจำเพาะสำหรับสารนั้นๆ ** ถ้าความเข้มข้น (c) เป็นโมลาร์ และ dx มีหน่วยเป็น ซม. จะเรียกค่า k ว่า molar extinction coefficient, ε มีประโยชน์ในการใช้หาความเข้มข้นของสารจาก OD เมื่อทราบεของสารนั้น

40 สารละลายนี้มีความเข้มข้นเท่าไหร่
A = ε c l A = absorption of solution ε = molar extinction coefficient (M-1 cm-1) l = path length of cuvette (cm) C = concentration (M) cuvette ตัวอย่าง สารละลาย tryptophan มีค่าการดูดกลืนแสง 0.55 ที่ 280 nm ใน cuvette ที่มีความหนา 0.5 cm , ε ของ tryptophan เท่ากับ 5600 M-1 cm-1 สารละลายนี้มีความเข้มข้นเท่าไหร่ C = A / (ε d) = 0.55/ ( ) = 1.96 x 10-4 M

41 - สารชีวโมเลกุลที่เป็น aromatic หรือมี conjugated double bond
สามารถดูดกลืนรังสีในแถบ ultraviolet ( nm) ได้ - carotene, hemoglobin, chlorophyll สามารถดูดกลืนแสงในช่วง visible light - nucleotide ซึ่งเป็นส่วนประกอบของ nucleic acid สามารถดูดกลืนรังสี Ultraviolet ได้ดีที่สุดที่ 260 nm (λmax = 260 nm) สาร λmax (nm) ε (M-1cm-1) Adenosine 5’-phosphate Cytidine 5’-phosphate Uridine 5’-phosphate Guanosine 5’-phosphate Phenylalanine Tyrosine Tryptophan NADH NADPH 259 271 262 252 257 275 280 338 339 15,400 9,000 10,000 14,000 200 1,300 5,000 6,220 6,200

42 3) Chemistry of Carbohydrates
PHOTOSYNTHESIS 6CO2 + 6H2O  C6H12O6 + 6O2 Plants are consumed by animals Animals release CO2 + H2O ENERGY METABOLISM 6O2+ C6H12O6  6CO2 + H2O + energy and BIOSYNTHESIS -C:H:O = 1:2:1 -General formula; (CH2O)n, n= 3-7 “monosaccharides” -Polysaccharides; starch, cellulose, glycogen

43 Type of carbohydrates Monosaccharides
-General formula; (CH2O)n, n= 3-7 -monosaccharides can be named on the basis of the functional group (carbonyl group) -monosaccharides contain many “Hydroxyl group (-OH)”  polyhydroxylaldehydes/ polyhydroxylketones Dihydroxyaldehyde (aldose) Dihydroxyacetone (ketose)

44 Monosaccharides: nomenclature
Functional group: aldose ketose Carbon atom: triose (C-3), tetrose (C-4), pentose (C-5), hexose (C-6)** Unique name: e.g., glucose (aldo-hexose) fructose (keto-hexose) galactose (…) glyceraldehyde (…)

45 Single asymmetric carbon
D- and L-configuration of monosaccharides -the prefixes D and L found in the complete name of monosaccharide are used to identify one of two possible isomeric forms called “stereoisomers” “ stereoisomers …same molecular formula, same bonding, but different in arrangement ” Single asymmetric carbon or Chiral carbon

46 D & L sugars = mirror Images, same name
น้ำตาลที่มี chiral center มากกว่า 1 ตำแหน่ง จะพิจารณา D, L จาก asymmetric C ที่อยู่ไกลจาก aldehyde or keto group มากที่สุด Most naturally occurring sugars are D isomers. D & L sugars = mirror Images, same name

47 Enantiomers: Diastereoisomers: Epimers:
Stereoisomers ที่สมมาตรกันเหมือนส่องกระจก เช่น D-glucose กับ L-glucose Diastereoisomers: Stereoisomers ที่ไม่มีคุณสมบัติเป็น Enantiomers Epimers: Diastereoisomers ที่มีตำแหน่ง chiral C ที่สมมาตรกันเพียง 1 ตำแหน่ง

48 Enantiomers HO H Epimers

49 การพิจารณา D-, L- configuration ไม่เกี่ยวข้องกับ
การหมุนระนาบแสง (optical rotation) Levorotatory sugar (S- หรือ (-)- sugar): หมุนไปทางซ้าย ทวนเข็มนาฬิกา Dextrorotatory sugar (R- หรือ (+)-sugar): หมุนไปทางขวา ตามเข็มนาฬิกา สามารถพบกลูโคสทั้งแบบที่เป็น D(+) glucose และ D(-) glucose L(+) glucose และ L(-) glucose

50 จำนวน isomers เท่ากับ 2n ; n คือจำนวน chiral carbon

51 The D-aldose Family

52 Dihydroxyacetone D-ribulose D-fructose

53 เมื่อกลูโคสอยู่ในรูปของสารละลาย
a- b- configuration of monosaccharides เมื่อกลูโคสอยู่ในรูปของสารละลาย Hemiacetal formation Cyclization หมู่ด้านขวา ... ชี้ลงล่าง หมู่ด้านซ้าย ... ชี้ขึ้นบน และ b glucose; Diastereoisomers ที่มีความแตกต่างกัน เฉพาะ C-1 (anomeric carbon) เกิด chiral carbon ใหม่ที่ C-1 เรียกว่า “anomeric carbon atom”

54 สลายพันธะ C=O สลายพันธะ OH

55 1 4 5 2 3

56 ลองสังเกตความแตกต่างของ ribose, fructofuranose และ glucofuranose
อ่านเพิ่มเติม กรณี ketose  Hemiketal formation (C-2 & C-6) C2 & C5 Pyranose Furanose C2 & C6 ลองสังเกตความแตกต่างของ ribose, fructofuranose และ glucofuranose

57 ดังนั้น ในสารละลายกลูโคสเราจะพบทั้ง - โครงสร้างโซ่เปิด
การเกิดโครงสร้างที่เป็นวงของ monosaccharides อาจเกิดได้ทั้งที่เป็นวง 6 เหลี่ยม (pyranose) และวง 5 เหลี่ยม (furanose) และเป็นได้ทั้งรูป a- และ b- ในสัดส่วนต่างๆกัน ดังนั้น ในสารละลายกลูโคสเราจะพบทั้ง - โครงสร้างโซ่เปิด - b-glucopyranose - a-glucofuranose C1&C4 write by yourself !! - b-glucofuranose - a-glucopyranose

58 b-form opened chain a-form
“Mutarotation” Glc ปกติกลูโคสมีจุดหลอมเหลว เท่ากับ 146C (Glc-ธรรมดา) Heat >98ﾟC ผลึกกลูโคสจะมี จุดหลอมเหลว 150ﾟC (Glc-ผลึก) Different optical rotation: Glc-ธรรมดา: +112ﾟ +52.7ﾟ Glc-ผลึก:+18.7ﾟ+52.7ﾟ จากผลการวิเคราะห์ด้วย X–ray พบว่า Glc-ธรรมดา คือ a-D-glucose: 36% Glc-ผลึก คือ b-D-glucose: 64% (ถ้าไม่นับรูปโซ่เปิด)

59

60 [hemiacetal formation**]
Glycoside formation เมื่อน้ำตาลทำปฏิกิริยากับเมทานอลในสารละลายที่เป็นกรดจะได้ anomeric methyl acetals Acetal ของคาร์โบไฮเดรต เรียกว่า glycoside เช่น glucoside หรือ glucopyranoside, manoside เป็นต้น Glycoside จะเสถียรในสารละลายเบส Glycoside ในสารละลายกรดจะเกิด hydrolysis ให้น้ำตาล กับ แอลกอฮอล์ (aglycone) [H+] [acetal formation**] [hemiacetal formation**]

61 *Formation of glycosidic bond
เสมือนเป็นหมู่ CH3

62 Oxidation of monosaccharides
เป็นปฏิกิริยาที่มีความสำคัญอย่างมากในสิ่งมีชีวิต - oxidation of carbohydrates to CO2 and H2O in aerobic processes ทำให้ได้พลังงาน - photosynthesis in plants Benedict’s reagent/ Tollens reagent/ Fehling reagent - สำหรับตรวจวัดน้ำตาล reducing (ทั้ง aldose และ ketose โดย Ketose จะเปลี่ยนเป็น aldose ในสารละลายที่เป็นเบส) - สารทดสอบเป็น oxidizing agent พวกเกลือของทองแดงในสารละลายด่าง; Benedict’s Solution (Cu2+citrate ในเบสอ่อน), Fehling Solution (Cu2+tartrateในเบสแก่) และ Tollens reagent [Ag+(NH3)2OH] - Positive test: ตะกอนสีแดงอิฐของ Cu2O หรือ โลหะเงินฉาบอยู่ข้างหลอด (Tollens) ตะกอนที่ได้อาจมีสีเหลือง เขียว ส้ม แดง ขึ้นอยู่กับปริมาณคาร์โบไฮเดรทที่ใช้ทดสอบ และอัตราเร็วในการเกิดตะกอน คาร์โบไฮเดรทขนาดใหญ่ เช่น polysaccharide จะไม่แสดงคุณสมบัติ reduce เนื่องจากโมเลกุลจะไปบดบังหมู่ aldehde/ ketone อิสระ

63 Benedict’s Test

64 THE TOLLENS TEST Aldehydes (but not ketones) are oxidized by Ag2O in aqueous ammonia to give the carboxylic acid and metallic silver "silver mirror"

65 น้ำตาล reducing?? Positive test ของ reducing sugar กับ oxidizing reagent เกิดจากการมีหมู่ hemiacetal โดยปกติคาร์โบไฮเดรตที่มีหมู่ hemiacetal (cyclic) จะอยู่ใน สภาพสมดุลกับโซ่เปิดในสาร ละลาย โครงสร้างแบบโซ่เปิดจะทำปฏิกิริยากับ oxidizing agent จนกว่า reagent หรือน้ำตาลจะหมดไปจากระบบ (p.27) น้ำตาล ketose ในสารละลายที่เป็นเบส (Benedicts solution ฯลฯ) มีสภาพเป็นเบส) จะเปลี่ยนไปเป็นน้ำตาล aldose และสามารถเกิดปฏิกิริยากับ oxidizing reagent ได้ คาร์โบไฮเดรตที่มีเฉพาะหมู่ acetal จะไม่ให้ positive test กับ Benedict’s หรือ Tollens’ solutionเนื่องจาก acetal ในสารละลายที่เป็นเบสจะเสถียรและไม่เกิดสมดุลระหว่างโครงสร้างแบบโซ่เปิด

66 Reducing end of branched polysaccharides;
have a number of nonreducing ends but only one reducing end Glucose หลายๆโมเลกุลต่อกันด้วยพันธะ glycosidic Non-reducing end Glucose Reducing end Non-reducing end Reducing end

67 2) Bromine water; the synthesis of aldonic acid
นํ้าโบรมีน (pH 6.0) เป็นรีเอเจนต์ที่สามารถเลือกออกซิไดซ์ (selectively oxidize) หมู่ –CHO ให้เป็นหมู่ –COOH ได้ โดยจะเปลี่ยน aldose ให้เป็น aldonic acid ดังสมการ Xylose Xylonic acid

68 2) Nitric acid; the synthesis of aldaric acid
Strong oxidizing agent = nitric acid (HNO3) เข้าทำปฏิกิริยากับทั้ง aldehyde และ primary alcohol Xylaric acid Xylose

69 Reduction of monosaccharides
Alditol synthesis การรีดิวซ์แอลโดสและคีโตสด้วย sodium borohydride หรือ แก๊สไฮโดรเจนโดยมีโลหะเป็นตัวคะตะลิสต์จะได้ สารประกอบที่เรียกว่า อัลดิตอล (Alditol) เป็นผลิตภัณฑ์ ดังสมการ Name Sweetness (sucrose = 1.0) Caloric content (kcal/g) Glycerol Lactitol Maltitol Mannitol Sorbitol Xylitol 0.6 0.4 0.9 0.5 1.0 4.3 2.0 2.1 1.6 2.6 2.4

70 เมตาบอลิสมของไซลิทอล
เกิดขึ้นที่ลำไส้เล็ก (Passive diffusion)และตับ (เปลี่ยน xylitol ไปเป็น fructose-6phosphate เข้าวิถี pentose-phosphate โดยปกติร่างกายสามารถรับไซลิทอลได้ในปริมาณ กรัม/วัน การผลิตไซลิทอลสามารถทำได้ทั้งวิธีทางเคมี และชีวภาพ (Xylose reductase จากยีสต์)

71 จากการวิจัยของ สมาคมทันตกรรม (USA) ระบุว่าควรเคี้ยวหมากฝรั่งที่มีส่วนผสมของไซลิทอล 6-12 เม็ดต่อวัน อย่างน้อย 5 นาที วันละ 3 ครั้ง หลังอาหารมื้อหลัก และต้องเป็นหมากฝรั่ง ซึ่งมีไซลิทอลผสมร้อยละ 50 ขึ้นไป เพราะจากผลการวิจัยต้องให้ไซลิทอลอยู่ในปากไม่ต่ำกว่า 5 นาที” การเคี้ยวหมากฝรั่งชนิดไซลิทอลสามารถลดการเกิดฟันผุได้ถึง 59 – 74% (เมื่อเทียบกับคนที่ไม่เคี้ยวหมากฝรั่ง ที่มา: สาโรจน์ ศิริศันสนียกุล 2547.ไซลิทอล,อุตสาหกรรมเกษตร,5 (3),13-27.

72 CPP-ACP: Casein phosphopeptide and Amorphus calcium phosphate
RECALDENT CPP-ACP: Casein phosphopeptide and Amorphus calcium phosphate  

73 + สารประกอบเชิงซ้อนที่มีสี
การตรวจ furfuralหรืออนุพันธ์ของมันจากการต้มน้ำตาลกับกรด phenol compound e.g., orcinol anthrone + สารประกอบเชิงซ้อนที่มีสี Furfural Sugar in acid Bial’s test (orcinol, conc.HCl, FeCl3): สีฟ้าเขียว กับ pentose Seliwanoff’s (resorcinol, 3M HCl): สีแดงกับ hydroxymethylfurfural ของ ketohexose สีชมพูกับ hydroxymethylfurfural (HMF) ของ aldohexose Molisch’s test (a-naphthol, H2SO4): วงแหวนสีม่วงแดง all carb. (เป็นการทดสอบเชิงคุณภาพ) ** Anthrone’s (anthrone, H2SO4): สีฟ้าเขียว กับ all carb. ** สามารถหาปริมาณของ carbohydrate ได้โดยการวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 620 nm (แต่ถ้าเป็น glycoprotein tryptophan จะทำให้ได้ผลการทดลองเป็นสีแดง)

74 การทดสอบ carbohydrate ด้วยสารละลาย Iodine
ใช้ทดสอบ polysaccharide โดยจะเกิดเป็นสารประกอบเชิงซ้อนที่มีสีแตกต่างกัน เช่น amylose จะให้สารประกอบเชิงซ้อนสีน้ำเงินเข้ม amylopectin และ glycogen จะให้สารประกอบเชิงซ้อนสีม่วงแดง dextrin จะให้สารประกอบเชิงซ้อนสีน้ำตาลแดง cellulose ไม่เกิดปฏิกิริยากับ iodine monosaccharide & disaccharide ไม่เกิดปฏิกิริยากับiodine

75 น้ำตาลโมเลกุลคู่ที่ได้จากการนำ monosaccharide 2 molecules มาต่อกันด้วย
Disaccharides น้ำตาลโมเลกุลคู่ที่ได้จากการนำ monosaccharide 2 molecules มาต่อกันด้วย พันธะ Glycosidic Maltose; glucose + glucose Lactose; glucose + galactose Sucrose; glucose + fructose “ Sucrose เป็น non-reducing sugar ”

76 Maltose Cellobiose

77 ในแป้งมีโครงสร้างอยู่ 2 แบบ
Polysaccharides starch: found in plants.  It's a polymer of glucose linked (a 1->4) and a 1->6 in branches.  ในแป้งมีโครงสร้างอยู่ 2 แบบ Amylose; no branches (helix) Amylopectin; branches (every glucose unit)  Starch granules consist of about 20% amylose and 80% amylopectin 

78

79 Protein Fat Carbohydrate Cellulose
COMPOSITION OF CEREALS Protein Fat Carbohydrate Cellulose Wheat Oats Rice Oats Rye Corn Rye Buckwheat Oats Barley Corn Barley Barley Buckwheat Wheat Wheat Corn Rice Barley Rye Buckwheat Wheat Buckwheat Corn Rice Rye Oats Rice

80 starch: amylose (a 1-4 linked) จากตับอ่อนและลำไส้เล็ก
4) Metabolism of Carbohydrates Polysaccharides: Glycogen (in animals), starch (in plants) = แหล่งพลังงานสำรอง starch: amylose (a 1-4 linked) amylase ในน้ำลาย maltose maltotriose amylase, maltase จากตับอ่อนและลำไส้เล็ก glucose Glycogenesis Glycolysis Energy reserve: glycogen Energy source for biosynthesis

81 starch: amylopectin (a 1-4 and a 1-6) จากตับอ่อนและลำไส้เล็ก
amylase ในน้ำลาย ย่อยที่ a 1-4 amylase, maltase, a 1-6 glucosidase จากตับอ่อนและลำไส้เล็ก sucrase or invertase sucrose + H2O  glucose + fructose lactase Glycogenesis Glycolysis lactose + H2O  glucose + galactose Energy reserve: glycogen Energy source for biosynthesis

82 เมื่อระดับน้ำตาลในเลือดสูง ... glucose  glycogen
GLYCOGENESIS G HOH2C glucose G HOH2C ATP: adenosine P-P-P UDP hexokinase and glucokinase glucose-6- phosphate + ADP: adenosine P-P glycogen synthase phosphoglucomutase (PGM) UTP: uridine P-P-P G HOH2C glucose-1- phosphate + PPi UDP-glucose pyrophosphorylase UDP: uridine P-P UDP-glucose

83

84 การเกิดแขนงของ ไกลโคเจน
เมื่อกลูโคสถูกเติมเข้าไปในสายหลักยาว มากกว่า11 โมเลกุล กลูโคสประมาณ 6-7 โมเลกุลจะหลุดจากสายหลัก เปลี่ยนไปเป็นสายแขนง โดยการทำงานของ branching enzyme (BM); amylo-(1,4 1,6)-transglycosylase เชื่อมสายหลักกับสายแขนงด้วยพันธะ a-1-6 ที่ประมาณโมเลกุลที่ 4 ในสายหลัก Reducing end 1 4 6 1 BM Non-reducing end a,1-6

85 เมื่อระดับน้ำตาลในเลือดต่ำ ... glycogen  glucose
GLYCOGENOLYSIS debranching enzyme G HOH2C phosphorylase glucose-1-phosphate P phosphoglucomutase (PGM) glucose-6-phosphate OH2C Glucose-6-phosphatase (release glucose unit and add phosphate) hydrolase (a 1-6) amylo-1,6-glucosidase

86 Phosphorylase - เร่งการย้ายเอา glucose residue ออกจาก non-reducing ends ของสายไกลโคเจน ตัดไกลโคเจนที่ Glc ตำแหน่งที่ 4 ที่ห่างจากจุดแยก a-(1-6 ) branch point แล้วเหลือ limit dextrin – limit dextrin ถูกย่อยต่อด้วย debranching enzyme (glucanotransferase) โดยจะย้ายกลูโคส 3 units จาก branch ให้มาต่อกับ branch อีกอันหนึ่ง amylo-1,6-glucosidase จะย่อยพันธะ a-(1-6 ) ได้ผลิตภัณฑ์เป็น กลูโคสอิสระ ส่วนสายหลักของไกลโคเจน จะถูกย่อยโดย phosphorylase ต่อไป (ได้ผลิตภัณฑ์เป็น G-1-P)

87 phosphoglucomutase (PGM) Glucose-6-phosphatase
GLYCOGENESIS GLYCOGENOLYSIS glycogen glycogen synthase UDP phosphorylase branching enzyme UDP-glucose debranching enzyme UDP-glucose pyrophosphorylase amylo (1-6) glucosidase UTP Glucose-1-phosphate phosphoglucomutase (PGM) Glucose-6-phosphate ADP hexokinase glucokinase Glucose-6-phosphatase ATP glucose

88 Pentose phosphate pathway Alcoholic fermentation
METABOLISM OF GLUCOSE Catabolism of glucose: GLYCOLYSIS Glucose synthesis: GLUCONEOGENESIS glucose GLYCOGENESIS Pentose phosphate pathway GLYCOLYSIS GLUCONEOGENESIS Ethanol + CO2 pyruvate lactate Alcoholic fermentation Lactic fermentation Oxygen KREBS’ CYCLE 6CO2

89 Glycolysis หรือ Embden-Meyerhof pathway
- Glycolysis เกิดใน Cytoplasm - แบ่งเป็น 2 ตอน C-6 (glucose)  C-3 (triose phosphate) ใช้พลังงาน 2 ATP/ glucose 2. Oxidoreduction; C-3  pyruvate ได้พลังงาน 4 ATP/ glucose ปฏิกิริยาที่ phosphorelytion of a-D-glucose ---> glucose 6-phosphate (G-6-P); hexokinase; ใช้ ATP ปฏิกิริยาที่ G-6-P ---> fructose 6-phosphate (F-6-P); phosphoglucoisomerase ปฏิกิริยาที่ phosphorelytion of F-6-P ---> fructose 1,6-diphosphate (FDP); phosphofructokinase; ใช้ ATP ปฏิกิริยาที่ FDP แยกตัวออกเป็น C-3 สองตัว คือ dihydroxyacetone phosphate (DHAP) กับ D-glyceraldehyde 3-phosphate (GAP); aldolase ปฏิกิริยาที่ isomerization ระหว่าง DHAP กับ GAP; triose phosphate isomerase ปฏิกิริยาที่ 6 Oxidation of GAP โดย NAD+ ---> 1,3-di-phosphoglycerate (DPG) และ NADH; glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase ปฏิกิริยาที่ 7 DPG ให้ phosphate แก่ ADP ---> 3-phosphoglycerate (3PGA) และ ATP; phosphoglycerate kinase; ได้ 2ATP ปฏิกิริยาที่ 8 3PGA ---> 2-phosphoglycerate (2PGA); phosphoglyceromutase ปฏิกิริยาที่ 9 Dehydration of 2PGA ---> phosphoenolpyruvate (PEP); enolase ปฏิกิริยาที่ 10 PEP ---> pyruvate; pyruvate kinase ; ได้ 2ATP

90 dehydrogenase Glycolysis (p.38)

91 Lactate dehydrogenase Lactic acid fermentation [Anaerobic condition]
Pyruvate was reduced to lactate by NADH from step 6 NAD+ was returned to use in step 6 glucose Muscle: extreme exercise !! Lactic acid bacteria GLYCOLYSIS NAD+ NADH pyruvate lactate Lactate dehydrogenase Lactic acid fermentation [Anaerobic condition]

92 [Anaerobic condition]
Ethanol fermentation glucose [Anaerobic condition] YEAST GLYCOLYSIS Acetaldehyde was reduced to ethanol by NADH from step 6 NAD+ was returned to use in step 6 pyruvate CO2 acetaldehyde NADH NAD+ ethanol

93 The Pasteur effect Louis Pasteur ได้สังเกตพบว่าในสภาวะที่ไม่มีออกซิเจน (anaerobic condition) เซลล์ยีสต์สามารถเจริญได้ดี และมีอัตราการใช้กลูโคสและการผลิตเอธานอลที่สูงมากกว่าสภาวะที่มีออกซิเจน (aerobic condition) เซลล์กล้ามเนื้อจะมีการสะสมของกรดแลกติกภายใต้สภาวะที่ไม่มีออกซิเจน ภาวะที่ glycolytic activity ลดช้าลงในสภาวะที่มีออกซิเจน เรียกว่า Pasteur effect

94 การใช้พลังงานจาก monosaccharides ชนิดอื่นๆ
Fructose fructokinase Fructose-1-P Fructose 1-phosphate aldolase Glyceraldehyde dihydroxyacetone phosphate Triose kinase Triose phosphate isomerase Glyceraldehyde 3-phosphate Pyruvate

95 Galactosemia & Lactose intolerance
glycogen Glycogen synthase PPi ATP galactokinase phosphorylase Gal-1-phosphate UDPGlc NAD+ Glc-1-phosphate Uridine Diphosphogalactose 4-epimerase Gal-1-phosphate uridyl transferase UDPGal phosphoglucomutase Glc-1-phosphate Glc-6-phosphate Glc-6-phosphate Glucose-6-phosphatase Pyruvate Glucose

96 gluconeogenesis เป็นการสังเคราะห์ glucose จากสารต่างๆที่ไม่ใช่ carbohydrate โดยเริ่มจาก pyruvate การสังเคราะห์ PEP จาก pyruvate pyruvate kinase PEP Pyruvate + ATP PEP Oxaloacetate Pyruvate + ATP + CO2 GTP PEP carboxykinase pyruvate carboxylase [Acetyl CoA] [Biotin] GTP จากนั้นจะเป็นการทวนกลับของ glycolysis จนได้ fructose1,6 bisphosphate (F-1,6 diphosphate: FDP) ในปฏิกิริยาสุดท้าย glucose 6-phosphate เปลี่ยนเป็น Glucose โดยเอนไซม์ glucose 6-phosphatase

97 Gluconeogenesis: The synthesis of glucose
p Biotin Acetyl CoA ทวน glycolysis *

98 สารต้นตออื่นๆ สำหรับการสังเคราะห์กลูโคส Dihydroxyacetone phosphate
LACTATE TO PYRUVATE Gluconeo genesis Fatty acid pyruvate glucose glycerol Glycerol kinase ATP ATP Glycolysis Lactate dehydrogenase Glycerol 3-phosphate lactate lactate CO2+H2O CORI CYCLE flavin-containing glycerol 3-phosphate dehydrogenase complex AMINO ACID TO PYRUVATE Dihydroxyacetone phosphate a-ketoglutarate e.g. glutamate glucose pyruvate TRANSAMINATION; glucose-alanine cycle

99

100 Pentose phosphate pathway; PPP (p. 48-49)
Glucose  glucose 6-phosphate  Pentose phosphate pathway (Hexose monophosphate shunt) ความสำคัญ ผลิต NADPH และสร้าง ribose 5-phosphate Source of reaction; อวัยวะที่มีการสังเคราะห์กรดไขมันและสเตียรอยด์ เช่น ต่อมหมวกไต Pentose phosphate pathway แบ่งได้เป็น 2 ระยะคือ oxidative stage; สร้าง NADPH จากการเปลี่ยน hexose (Glc 6-P) ไปเป็น pentose (ribose 5-phosphate) Glc-6-P + 2NADP+ + H2O ribulose 5-P + 2NADPH + CO2 + 2H+ non-oxidative stage; ribulose 5-phosphate ถูกเปลี่ยนต่อไปเป็น glycolytic intermediate; fructose 6-phosphate และ glyceraldehyde 3-phosphate 3ribulose 5-P Frc-6-P + glyceraldehyde 3-phosphate fructose 6-phosphate และ glyceraldehyde 3-phosphate จะถูกเมแทบอไลซ์ใน glycolysis และ gluconeogenesis ได้

101 การควบคุม Glc-6-P dehydrogenase; self limiting
3 3 การควบคุม Glc-6-P dehydrogenase; self limiting

102 3 (2 โมเลกุล) C5 C5 C3 C7 C4 C6 C6 C3 ผลิตภัณฑ์สุดท้ายที่ได้ถูกนำกลับไปสังเคราะห์ Glc-6P โดย riburose-5-P 6 โมเลกุลจะได้ Glc-6-P 5 โมเลกุล

103 Pathways of carbohydrate metabolism
GLYCOGENESIS GLYCOGENOLYSIS GLYCOLYSIS หรือ Embden-Meyerhof Pathway GLUCONEOGENESIS PENTOSE PHOSPHATE PATHWAY

104 From Glycolysis to . . . Krebs Cycle
Cytoplasm ดังนั้น การสลายกลูโคส 1 โมเลกุล ในสภาวะที่มีออกซิเจน (aerobic condition) 2Acetyl CoA + 2CO2 + 2ATP + 4NADH Glycolysis anaerobic condition pyruvate pyruvate Pyruvate dehydrogenase complex Krebs Cycle Mitochondria aerobic condition CH3COSCoA CO2 NADH

105 MITOCHOHDRIA Pyruvate translocase CYTOSOL outer membrane
inner membrane HS-CoA CO2 MATRIX Pyruvate Pyruvate Acetyl CoA TCA cycle H+ NAD+ NADH.H+

106 Krebs Cycle; Tricarboxylic acid cycle (TCA cycle)
1. Acetly CoA รวมตัวกับ Oxaloacetic acid; citrate synthase  citric acid 2,3 Citric acid จะสูญเสียน้ำ  cis-aconitic acid ซึ่งจะรวมตัวกับน้ำอีก  isocitric acid (เป็นการเปลี่ยนตำแหน่ง –OH จาก a ในcitric acidไปเป็น b ใน isocitric acid ); aconitase 4,5 ปฏิกิริยา oxidative decarboxylation ใช้ NAD+ เป็นโคเอนไซม์ isocitric acid จะให้ CO2 และ NADH  a-keto-glutaric acid; isocitrate dehydrogenase 6. a-keto-glutaric acid ให้ CO2 และ NADH  Succinyl CoA; a-keto-glutarate dehydrogenase complex Succinyl CoA เป็นสารพลังงานสูง จะแตกตัวเป็น succinic acid และ Coenzyme A (CoASH) ขณะเดียวกันพลังงานที่ได้จะรวมกับ GDP และ phosphate (จาก ATP) ได้เป็น GTP: succinyl thiokinase Succinic acid ถูกoxidized  Fumaric acid และ FADH; succinate dehydrogenase Fumaric acid รวมตัวกับน้ำได้ malic acid; fumarase Malic acid ถูก oxidized ด้วย NAD+ เป็น oxaloacetate และ NADH; malate dehydrogenase

107 dehydrogenase complex isocitrate dehydrogenase
Krebs Cycle citrate synthase malate dehydrogenase aconitase fumarase a-keto-glutarate dehydrogenase complex succinate dehydrogenase isocitrate dehydrogenase NADre = NADH ตัวให้ e- NADox = NAD+ ตัวรับ e- succinyl thiokinase

108 จาก Krebs Cycle ใน mitochondria
สู่ลูกโซ่การหายใจ (Respiratory Chain) เมื่อสิ้นสุด Krebs Cycle 1 รอบ (Acetyl CoA 1 molecule) จะได้: (1GTP + 3NADH +1FADH2) X2 Reducing equivalence ที่ได้จาก Krebs cycle จะถูก oxidized โดยการผ่านอิเล็กตรอนเข้าไปในลูกโซ่ การหายใจ หรือลูกโซ่การขนส่งอิเล็กตรอน (electron transport chain) ซึ่งประกอบด้วย flavoprotein (FP) ชนิดต่างๆ, Coenzyme Q และ Cytochrome หลายชนิด O2 จะเป็นตัวรับอิเล็กตรอนจากอีกปลายหนึ่งของลูก โซ่นี้แล้วเปลี่ยนไปเป็นน้ำ Mitochondrial NADH NAD+ ox FP red CoQ Cytb CytC1 CytC Cyta, a3 1/2 O2 H2O

109 OXIDATIVE PHOSPHORYLATION
ระหว่างขนส่งอิเล็กตรอนจาก flavoprotein ถึง oxygen พลังงานที่ได้จะถูกนำไปสังเคราะห์ ATPจาก ADP และ phosphate โดยวีธีการควบคู่ (Coupling) กระบวนการสังเคราะห์ ATP นี้เรียกว่า “OXIDATIVE PHOSPHORYLATION” ปฏิกิริยาที่ให้พลังงาน ATP คือ 1) ปฏิกิริยาระหว่าง NADH กับ FP 2) ปฏิกิริยาระหว่าง Cytb กับ CytC1 3) ปฏิกิริยาระหว่าง Cyt a,a3 กับ 1/2O2 พลังงานที่ได้จากการขนส่ง e- จาก NADH จะให้ 3 ATPพลังงานที่ได้จากการขนส่ง e- จาก FADH2 จะให้ 2 ATP P OXIDATIVE PHOSPHORYLATION ATP ADP พลังงาน ATP ATP Mitochondrial NADH Succinate Fatty Acyl CoA Glycerol phosphate FP CoQ Cytb Cytc Cytc Cyta + a /2 O2 FP2 FP3 FP4 FP1: NADH dehydrogenase FP2: succinate dehydrogenase FP3: acetyl CoA dehydrogenase FP4: glycerol 3-phosphate dehydrogenase

110

111 2. b-hydroxybutyrate shuttle 3. Malate shuttle
NADH ใน cytoplasm - NADH, FADH2 สามารถให้ ATP ออกมาได้โดยการผ่านอิเล็กตรอนเข้าไปในลูกโซ่การหายใจ - เกิดใน mitochondria เท่านั้น - NADH และ FADH2 ที่เกิดใน mitochondria สามารถผ่านอิเล็กตรอนเข้าไปในลูกโซ่การหายใจได้เลย - NADH ที่ได้จาก Glycolysis ใน Cytoplasm ไม่สามารถซึมผ่านผนังของ mitochondria ได้ ระบบลำเลียง (shuttle system) ที่นำ reducing equivalence เช่น NADH ใน cytoplasm เข้าสู่ mitochondria เพื่อเข้าสู่ลูกโซ่การหายใจ 1. Glycerol phosphate shuttle 2. b-hydroxybutyrate shuttle 3. Malate shuttle

112 GP-dehydrogenase complex
ระบบลำเลียง NADH ใน cytoplasm ไปยัง mitochondria I II III Cytoplasm NADH+H+ NAD+ OAA Malate NADH+H NAD+ DHAP GP NADH+H+ NAD+ Acetoacetate b-hydroxybutyrate Malate dehydrogenase GP-dehydrogenase Intermembrane space Aspartate DHAP GP [FP4H2] [FP4] Acetoacetate b-hydroxybutyrate NADH+H NAD+ GP-dehydrogenase complex Aspartate FP1 1/2 O2 Inner membrane (cristae) CoQ 1/2 O2 3(ADP + Pi) 3ATP 2(ADP + Pi) 2ATP 3ATP 3(ADP + Pi) 1/2 O2 FP1 Malate dehydrogenase OAA Malate NADH+H NAD+ matrix

113 จำนวน ATP ที่ได้จาก Glycolysis และการหายใจ (respiration)
กระบวนการ ใช้ไป ผลิตได้ ได้จาก reducing equivalence รวม Glycolysis: Glucose pyruvate ATP ATP NADH = 4 ATP หรือ 8 ATP หรือ 6ATP Pyruvate dehydrogenase: 2 pyruvate acetyl CoA + 2 CO NADH = 6 ATP ATP Krebs Cycle: 2 Acetyl CoA CO GTP NADH = 18 ATP ATP = 2ATP FADH2 = 4 ATP GLUCOSE CO ATP ATP หรือ 34 ATP หรือ 38 ATP

114 5. Bioenergetics and electron transport
สิ่งมีชีวิตต้องการใช้พลังงานสำหรับกิจกรรมต่างๆ Thermodynamics: การศึกษาการเปลี่ยนแปลงพลังงานในรูปต่างๆ และสมดุลของพลังงานในระบบ System: closed system and open system สิ่งมีชีวิตจัดเป็นระบบเปิด - Bioenergetics: The study of energy transformation in living matter using the basic principles of thermodynamics กฏข้อที่ 1. ของ thermodynamics ผลรวมของพลังงานในระบบและสิ่งแวดล้อมมีค่าคงที่เสมอ Heat (q) ΔE Work (w) system ΔE : พลังงานภายในระบบ ΔE = q-w ถ้าไม่มีงานออกมา, w = 0 นั่นคือ ΔE = q

115 แต่การวัดการเปลี่ยนแปลงพลังงานภายในระบบ (∆E) ทำได้ยาก
Enthalpy (ΔH): most living systems operate the constant T and P, ΔE = the change in the total heat energy (Enthalpy,ΔH) ดังนั้น ΔH = q-w ΔH = negative  ระบบมีการคายพลังงาน; exothermic ΔH = positive  ระบบมีการดูดพลังงาน; endothermic C6H12O O CO H2O Molecules: State: solid gas gas liquid ΔH (kJ/mol) ΔH = [ΔH products] – [ΔH reactants] = [6X(-393) + 6X(-238)] – [1X (-912) + 0] = kJ/mol

116 Bioenergetics: Thermodynamics applied to biology
Entropy (ΔS) ของระบบปิดหรือ universe จะเพิ่มขึ้นเสมอ Entropy คือ ดัชนีชี้วัดความไม่เป็นระเบียบเรียบร้อยของระบบ ΔS = positive  reaction หรือกิจกรรมนั้นสามารถเกิดขึ้นได้เอง ΔS = negative  reaction หรือกิจกรรมนั้นต้องใช้พลังงานเข้าช่วย ΔS = q/T Bioenergetics: Thermodynamics applied to biology พลังงานอิสระ (FREE ENERGY) Δ H = TΔS – w หรือ – w = Δ H –TΔS Δ G = Δ H –TΔS ที่อุณหภูมิ และความดันคงที่ Δ G คือ ผลต่างพลังงานอิสระ หรือ Gibbs’ free energy “ในทางชีวเคมี หาผลต่างพลังงานอิสระในสิ่งมีชีวิตจากปฎิริยาเคมีที่เกิดขึ้น”

117 ผลต่างพลังงานอิสระมาตรฐาน (ΔG˚‘) และค่าคงที่สมดุล (Keq)
Δ G ของปฏิกิริยาเคมีจะขึ้นกับความเข้มข้นสารที่ทำปฏิกิริยา, T และ P Δ G˚ T = 25C (298K); P=1 atm; [reactant] = 1M ΔG˚‘ ในการศึกษาปฏิกิริยาทางชีวเคมี ... [H+] 1M at pH 7 is used ΔG˚‘ = -RTlnKeq A + B C + D Keq = [C][D] [A][B] ΔG˚‘ = -RTln[C][D] Direction of reaction ΔG˚‘ Energy change [A][B] = [C][D] Keq = zero [A][B] > [C][D] Keq < endergonic (ใช้พลังงาน) [A][B] < [C][D] Keq > exergonic (ให้พลังงาน) ΔG˚‘ เป็นลบมากๆ = spontaneous reaction

118 การดำเนินไปของปฎิกิริยา
G การดำเนินไปของปฎิกิริยา A+B C+D ∆G = 0 Direction; ไม่มีการใช้หรือให้พลังงาน A+B C+D A + B C + D ∆G = negative เป็นปฎิกิริยาให้พลังงาน (exergonic reaction) Spontaneous reaction ∆G = positive เป็นปฎิกิริยาใช้พลังงาน (endergonic reaction)

119 ปฏิกิริยาจะเกิดได้ง่ายขึ้นถ้ามีตัวไปลดพลังงานกระตุ้น
Energy of activation (ΔE) ปฏิกิริยาการสลาย glucose เป็น CO2 และน้ำมี ΔG˚‘ เป็นลบมากๆ Energy glucose + O2 CO2 + H2O ΔG˚‘ ΔE ΔG˚‘ เป็นลบ ΔG˚‘ เป็นบวก ปฏิกิริยาจะเกิดได้ง่ายขึ้นถ้ามีตัวไปลดพลังงานกระตุ้น

120 สารพลังงานสูง (High energy compounds)
คือสารที่เมื่อเกิด hydrolysis แล้วให้พลังงานอิสระออกมาเป็นจำนวนมาก หรือ ΔG˚‘ มีค่าเป็นลบมากๆ (7 kcal/mol) ΔG˚‘ และ Keq ของปฏิกิริยา hydrolysis ที่ 30C ของสารสำคัญในชีวเคมี: X-P +H2O  X-OH + Pi สาร (X-P) ΔG˚‘ (kcal/mol) Keq PEP X1010 1,3 DPG X108 ATP ( AMP+PPi) X105 ATP ( ADP + Pi) X105 Glucose 1-phosphate ,600 Fructose 6-phosphate Glucose 6-phosphate

121 (∆G) = (ผลรวม G ผลิตภัณฑ์) – (ผลรวม G สารที่ทำปฎิกิยา)
Bioenergetics and electron transport Introduction พลังงานอิสระของกิบส์ (Gibbs Free Energy: G) หมายถึง พลังงานที่เป็นประโยชน์ที่สามารถใช้เพื่อให้เกิดงานได้ สิ่งมีชีวิตใช้ และสังเคราะห์พลังงานอิสระในรูปของ ATP พลังงาน ADP + Pi ATP ∆G° = -7.3 kcal ∆G° = +7.3 kcal กระบวนการสลายอาหาร กระบวนการใช้พลังงานในร่างกาย การวัดค่าพลังงานอิสระ มักวัดเป็นค่าการเปลี่ยนแปลงพลังงานอิสระ (∆G) (∆G) = (ผลรวม G ผลิตภัณฑ์) – (ผลรวม G สารที่ทำปฎิกิยา)

122 ภาพแสดง∆G ในขั้นต่างๆของ glycolysis

123 การสร้างและการใช้ ATP
Photosynthesis 6CO2 + 6H2O  C6H12O6 + 6O2 sucrose and starch - สิ่งมีชีวิตที่ใช้ออกซิเจน ส่วนใหญ่ได้ ATP มาจากกระบวนการ oxidative phosphorylation ADP + Pi + พลังงานจาก coupling reaction (oxidation จากการสลายอาหาร) พืชสร้าง ATP จาก ADP และ Pi จากกระบวนการ photophosphorylation Carbon fixation 90%  microorganism in ocean 10%  on land (plant)

124 แสง LIGHT REACTION พลังงานเคมี DARK REACTION Photosynthesis H2O ½ O2
nCO2 (CH2O)n (ตัวให้อิเล็กตรอน) 6CO ATP + 12 NADPH + 12H+  Glucose + 18 Pi + 18 ADP + 12NADP+

125 Photosynthesis Absorption of light X
color pigments extracted from leaves “chlorophylls”  chlorophyll a chlorophyll a, X= CH3 chlorophyll b, X= CHO Porphyrin ring X

126 ใน Chloroplast มี cytochrome ชนิดต่างๆ
Chlorophyll c ในสาหร่ายสีน้ำตาล และ diatom Chlorophyll d ในสาหร่ายสีแดง Phycobillin P700

127 LIGHT REACTION Electron transport in plant
Photosystems in Plant -photosystem I (PSI): มี chlorophyll a จำนวนมาก -photosystem II (PSII): มี chlorophyll b จำนวนมาก Z scheme: - ถ้าการถ่ายทอด e- ไม่เป็นวัฏจักร จะได้ ATP + NADPH / 1 คู่e- - ถ้าไม่มีน้ำ PSII จะไม่ทำงาน การถ่ายทอด e- จะเป็นวัฏจักร จะได้ ATP / 1 คู่e- 12H2O + 12 NADP+  6O NADPH + 12H+

128 Z-scheme diagram Z NADPH Q ATP Photosystem II H2O Photosystem I
ferridoxin NADPH NADP+ Cytb6 Photosystem II 2e- Q plastoquinone Cytb 2e- 2e- H2O Cytf 2e- plastocyanin Pigment I P700 ATP 1/2O2 + 2H+ Photosystem I Pigment II P680

129 2X DARK REACTION (Calvin cycle) Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase
Phosphoglycerate kinase 2X Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase -Succinyl CoA synthetase -PEP carboxykinase

130 12H2O + 12 NADP+  6O2 + 12 NADPH + 12H+ 6CO2 + 6H2O  C6H12O6 + 6O2
Light Reaction 12H2O + 12 NADP+  6O NADPH + 12H+ Dark Reaction 6CO ATP + 12 NADPH + 12H+  Glucose + 18 Pi + 18 ADP + 12NADP+ Overall Reaction 6CO2 + 6H2O  C6H12O6 + 6O2

131 Oxidative phosphorylation Photophosphorylation
Substrate level phosphorylation เป็นการผลิต ATP โดยการถ่ายทอดหมู่ phosphate จากสารintermediate substrate ในexergonic pathway ให้กับADP

132 ADP ATP ADP ATP ADP + Pi ATP

133 PHOTOPHOSPHORYLATION
KEY WORDS OXIDATIVE PHOSPHORYLATION PHOTOPHOSPHORYLATION SUBSTRATE LEVEL PHOSPHORYLATION FREE ENERGY & ACTIVATED ENERGY ATP; HIGH ENERGY COMPOUND

134 GOOD LUCK ดูประกาศห้องสอบ midterm ที่หน้าห้อง lecture (CB 1320)
Introduction to the Biochemistry of Life Principle Methods of Biochemistry Chemistry of Carbohydrates Metabolism of Carbohydrates Electron Transport and Bioenergetics ดูประกาศห้องสอบ midterm ที่หน้าห้อง lecture (CB 1320) GOOD LUCK