ทบทวนความรู้ การสอบปฏิบัติการครั้งที่ 1 Qualitative analysis Quantitative analysis

Qualitative analysis

(test for monosaccharides) BIOCHEMICAL ANALYSIS Qualitative (คุณภาพวิเคราะห์) identify the components of a substance or mixture. e.g. xylose glucose fructose lactose sucrose (disaccharide) (monosaccharide) Barfoed’s test (test for monosaccharides)

Lab Carbohydrate chemistry

Lab Protein chemistry

Ninhydrin test ทดสอบสารที่มีหมู่ NH2 เสรี เช่น AÂ, โปรตีน และสาร amine ผลบวกคือ - สารละลายสีม่วง - ยกเว้น proline ได้สารละลายสีเหลือง

Biuret test ทดสอบสารที่มี peptide bond ในอณูตั้งแต่ 2 bond ขึ้นไป ผลบวกคือ - สารละลายสีม่วง

Coomassie blue G-250 test ทดสอบสารโปรตีนโดยใช้ dye-binding reaction ผลบวกคือ - สารละลายสีฟ้า

Bromcresol purple test ทดสอบสาร albumin ผลบวกคือ - สารละลายสีเขียว - ถ้ามากเกินไปอาจกลายเป็นสีน้ำเงินได้

Quantitative analysis

ระดับน้ำตาลในพลาสมา = 105 mg/dl BIOCHEMICAL ANALYSIS Quantitative (ปริมาวิเคราะห์) to determine the amounts or proportions of the components of a substance. e.g. ระดับน้ำตาลในพลาสมา = 105 mg/dl ระดับโปรตีนในซีรั่ม = 7.2 g/dl

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) หลักการ Io I Io = light intensity ก่อนผ่านสารละลาย (incident light) I = light intensity หลังผ่านสารละลาย (transmitted light) ความทึบแสง (optical density [O.D.] หรือ absorbance) = log Io/I O.D. หรือ absorbance เป็น 0 เมื่อไม่มีการดูดกลืนแสง (I = Io) O.D. หรือ absorbance > 0 เมื่อมีการดูดกลืนแสง (I < Io)

A = e l c = ค่าคงที่ของการดูดกลืนแสง (extinction coefficient) การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) หลักการ Lambert-Beer’s law A = e l c A= absorbance หรือ optical density (O.D.) = ค่าคงที่ของการดูดกลืนแสง (extinction coefficient) l = ระยะทางที่แสงผ่านสารละลาย c = ความเข้มข้นของสารละลาย เมื่อ ระยะทางที่แสงผ่านคงที่ \ O.D. = constant x concentration ดังนั้น การวัดความทึบแสง สามารถใช้วิเคราะห์หาปริมาณ ของสารที่ต้องการตรวจสอบได้

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) หลักการ Io I 0 2 4 8 mg/ml A a c c = ความเข้มข้นของสารละลาย A a l l = ระยะทางที่แสงผ่านสารละลาย l 1 l 2

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การหาความเข้มข้นของสาร A โดยวิธีเทียบความทึบแสง เครื่องวัดความทึบแสง (spectrophotometer) เตรียมสารละลายมาตรฐาน (standard solution) ของสาร A ที่รู้ความเข้มข้น e.g. ได้จากการชั่งสาร A และทำเป็นสารละลายที่มีความเข้มข้นที่ต้องการ เช่น 250, 500, 750, 1500 mg/dl สารละลาย unknown ที่ต้องการวิเคราะห์

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การหาความเข้มข้นของสาร A โดยวิธีเทียบความทึบแสง - วิธีที่ 2 เนื่องจากความสัมพันธ์ระหว่าง O.D. และ ความเข้มข้นเป็นเส้นตรง O.D. = constant x concentration อาจวัดความทึบแสงโดยใช้ standard solution เพียงค่าเดียว แล้วคำนวณหาค่าความเข้มข้นของ unknown ดังนี้ Ds = constant x Cs Du = constant x Cu Ds, Du = O.D. ของน้ำยามาตรฐานและ unknown Cs, Cu = concentration ของน้ำยามาตรฐานและ unknown 1 2 Cu = Du x Cs Ds

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การหาความเข้มข้นของสาร A โดยวิธีเทียบความทึบแสง e.g. Ds ของ standard solution 1500 mg/dl = 0.68 Du ของ unknown = 0.45 Cu = Du x Cs Ds Cu = 0.45 x 1500 mg/dl 0.68 Cu = 992 mg/dl

การเทียบความทึบแสง (Spectrophotometry) ตัวอย่าง การหาความเข้มข้นของสาร A ในปัสสาวะ โดยวิธีเทียบความทึบแสง วิธีการ ปัสสาวะถูกเจือจางด้วยน้ำกลั่น 50 เท่าก่อนที่จะนำมาทดสอบ (ใช้ปัสสาวะ 1 ส่วน เจือจางด้วยน้ำกลั่น 49 ส่วน) นำไปวัดความทึบแสงที่ 540 nm. ผลการทดสอบ Ds ของ standard solution 10 mg/dl = 0.4 Du = 0.2 จงคำนวณค่าความเข้มข้นของสาร A ในปัสสาวะ Cu = 0.2 x 10 0.4 = 5 mg/dl Dilutional factor = 50 ดังนั้น Cu = 5x50 = 250 mg/dl Cu = Du x Cs Ds

การใช้เครื่อง spectrophotometer

การใช้เครื่อง spectrophotometer การใช้ cuvette ควรมีน้ำยาใน cuvette ~ 1/2 ของหลอด (อย่างน้อยสุด ~ 1/3) hn Io I ก่อนใช้ cuvette ควร rinse cuvette ด้วยน้ำยาที่จะอ่าน 1-2 ครั้ง แต่ไม่ควรใช้น้ำยา rinse มาก จนทำให้เหลือน้ำยาไม่พอสำหรับอ่าน O.D.

การใช้เครื่อง spectrophotometer การใช้ cuvette จับ cuvette ให้ถูกวิธี ก่อนที่จะใส่ cuvette ลงในเครื่อง spectrophotometer ให้เช็ดข้างหลอดด้วยกระดาษทิชชูให้สะอาดเสมอ

การใช้เครื่อง spectrophotometer การใช้ cuvette sample holder ของเครื่อง spectronic 20 จะมีขีด (ลูกศรชี้) ที่เป็นเครื่องหมาย เพื่อให้ใส่ cuvette ได้ถูกต้อง โดยเครื่องหมายขีดขาวบนหลอด cuvette ต้องตรง กับขีดบน cuvette holder

Good luck