งานนำเสนอกำลังจะดาวน์โหลด โปรดรอ

งานนำเสนอกำลังจะดาวน์โหลด โปรดรอ

การตรวจการติดเชื้อ ไวรัสเวสต์ไนล์ ในประเทศไทย สุมาลี ชะนะมา

งานนำเสนอที่คล้ายกัน


งานนำเสนอเรื่อง: "การตรวจการติดเชื้อ ไวรัสเวสต์ไนล์ ในประเทศไทย สุมาลี ชะนะมา"— ใบสำเนางานนำเสนอ:

1 การตรวจการติดเชื้อ ไวรัสเวสต์ไนล์ ในประเทศไทย สุมาลี ชะนะมา

2 หัวข้อบรรยาย บทนำ บทนำ การตรวจสารพันธุกรรมวิธี RT-PCR การตรวจสารพันธุกรรมวิธี RT-PCR การตรวจสารพันธุกรรมวิธี Real-time RT-PCR การตรวจสารพันธุกรรมวิธี Real-time RT-PCR การตรวจแอนติบอดีวิธี ELISA และ IIFT การตรวจแอนติบอดีวิธี ELISA และ IIFT สรุป สรุป

3 บทนำ West Nile virus Family Flaviviridae, Genus Flavivirus Family Flaviviridae, Genus Flavivirus Vector: Culex mosquitoes Vector: Culex mosquitoes อาการเล็กน้อย มีไข้ ปวดศีรษะ ปวดตามร่างกาย อาจมีผื่น แดงที่ผิวหนัง ต่อมน้ำเหลืองโต ต่อมน้ำเหลืองโต อาการรุนแรง เยื่อหุ้มสมองอักเสบ สมองอักเสบ คอแข็ง มือสั่น ชัก กล้ามเนื้ออ่อนแรง เป็นอัมพาต ซึม สับสน หมดสติ กล้ามเนื้ออ่อนแรง เป็นอัมพาต ซึม สับสน หมดสติ อาการรุนแรงมาก เสียชีวิต ไม่มีวัคซีน ไม่มีวัคซีน

4

5 การตรวจสารพันธุกรรมวิธี RT- PCR เริ่มพัฒนาวิธีพ.ศ อ้างอิง NIID, Japan เริ่มพัฒนาวิธีพ.ศ อ้างอิง NIID, Japan ไพรเมอร์ 2 ชุดจำเพาะกับไวรัสเวสต์ไนล์ ส่วน Envelope (E) และส่วน Nonstructural 3 (NS3) ไพรเมอร์ 2 ชุดจำเพาะกับไวรัสเวสต์ไนล์ ส่วน Envelope (E) และส่วน Nonstructural 3 (NS3) PrimerSequenceProduct size WNNY514CGG CGC CTT CAT ACA CW408 bp (E) WNNY904GCC TTT GAA CAG ACG CCA TA Fla-U5004GGA ACD TCM GGH TCN CCH AT471 bp (NS3) Fla-U5457GTG AAR TGD GCY TCR TCC AT

6 ReagentVolume 2xOne-step RT-PCR buffer12.5 µl 10 µM WNV primers / Fla primers1.0 µl 10 µM BA-1 primer0.2 µl 10 µM BA-4 primer0.2 µl RNase inhibitor0.2 µl SuperScript III/RT/Taq Mix1.0 µl RNase free DW4.9 µl RNA sample5.0 µl การตรวจสารพันธุกรรมวิธี RT- PCR

7 cDNA synthesis: 50 o C 30 min cDNA synthesis: 50 o C 30 min Denaturation: 94 o C 2 min Denaturation: 94 o C 2 min Amplification: 94 o C 30 sec, 53 o C 30 sec, 72 o C 30 sec  40 cycles Amplification: 94 o C 30 sec, 53 o C 30 sec, 72 o C 30 sec  40 cycles Extension: 72 o C 5 min Extension: 72 o C 5 min การตรวจสารพันธุกรรมวิธี RT- PCR

8 E 408 bp NS3 471 bp

9 การตรวจสารพันธุกรรมวิธี RT- PCR E 408 bp NS3 471 bp

10 รวมจำนวนตรวจ เมษายน 2550 ถึง มิถุนายน ตัวอย่าง 245 ตัวอย่าง CSF 47 ตัวอย่าง CSF 47 ตัวอย่าง Serum 198 ตัวอย่าง Serum 198 ตัวอย่าง ผลตรวจ E region พบ weakly positive 4 ตัวอย่าง ผลตรวจ NS3 region พบ weakly positive 1 ตัวอย่าง ไม่สามารถตรวจยืนยันได้ว่าเป็น WNV infection จริงเนื่องจาก ตัวอย่างไม่พอส่งตรวจเพิ่ม การตรวจสารพันธุกรรมวิธี RT- PCR

11 การตรวจสารพันธุกรรมวิธี REAL- TIME RT-PCR เริ่มพัฒนาวิธีพ.ศ อ้างอิง J Virol Method 2005(126),

12 หลักการ TaqMan RT-PCR (5’Nuclease assay) TaqMan MGB probe TaqMan MGB probe MultiScribe Reverse transcriptase (recombinant Moloney Murine Leukemia Virus, MuLV, RT) MultiScribe Reverse transcriptase (recombinant Moloney Murine Leukemia Virus, MuLV, RT) AmpliTaq Gold DNA polymerase: 5’ to 3’ Nuclease activity AmpliTaq Gold DNA polymerase: 5’ to 3’ Nuclease activity ROX normalization  correct well-to-well fluorescent fluctuations ROX normalization  correct well-to-well fluorescent fluctuations Primer/Prob e SequenceProduct size WNV-FGCA CGA AGA TCT CGA TGT CTA AG75 bp WNV-RATT CCG CGT TTT AGC ATA TTG AC WN-JE probeACC AGG AGG GCC CGG (FAM-MGB) การตรวจสารพันธุกรรมวิธี REAL- TIME RT-PCR

13 TAQMAN PROBE Hydrolysis probe Hydrolysis probe Dual-labeled target-specific fluorescent probe Dual-labeled target-specific fluorescent probe Nucleotides contain a fluorescent dye on 5’ end and quenching dye on 3’ end Nucleotides contain a fluorescent dye on 5’ end and quenching dye on 3’ end

14 COMMONLY USED COMBINATIONS OF REPORTERS AND QUENCHERS ReporterCompatible Quencher FAMBHQ1, TAMRA TETBHQ1 HEXBHQ1, BHQ2 TAMRABHQ2 Texas RedBHQ2, BHQ3 ROXBHQ2, BHQ3 Cy5BHQ2, BHQ3

15 TAQMAN MGB PROBES 5’ reporter dye 5’ reporter dye 3’ non-fluorescent quencher (NFQ) = MGB (Minor groove binder) 3’ non-fluorescent quencher (NFQ) = MGB (Minor groove binder) Lower background signal Lower background signal Better precision in quantitation Better precision in quantitation Higher Tm, increased specificity Higher Tm, increased specificity Can be shorter than traditional dual-labeled probe Can be shorter than traditional dual-labeled probe FAM, VIC, TET, NED FAM, VIC, TET, NED

16 TAQMAN MGB PROBES

17 DYE SETS FOR ABI nm550 nm580 nm610 nm650 nm FAMJOETAMRAROXCY5 SYBR GreenVICNEDTEXAS RED TETCY3

18 cDNA synthesis 48 o C 30 min cDNA synthesis 48 o C 30 min Denature 95 o C 10 min Denature 95 o C 10 min Amplification 95 o C 15 sec, 60 o C 60 sec for 42 cycles Amplification 95 o C 15 sec, 60 o C 60 sec for 42 cycles Data collection Data collection

19 ReagentVolume 2x Master Mix12.5 µl 40x MultiScribe enzyme0.625 µl 20 µM WNV-F primer1.125 µl 20 µM WNV-R primer1.125 µl 10 µM WN_JE probe (FAM-MGB)0.625 µl RNase free DW6.0 µl RNA sample3.0 µl การตรวจสารพันธุกรรมวิธี REAL- TIME RT-PCR Target gene: Capsid region

20 ABI 7500 Real-time PCR machine ABI 7500 Real-time PCR machine cDNA synthesis: 48 o C 30 min cDNA synthesis: 48 o C 30 min Denaturation: 95 o C 10 min Denaturation: 95 o C 10 min Amplification: 95 o C 15 sec, 60 o C 60 sec  43 cycles Amplification: 95 o C 15 sec, 60 o C 60 sec  43 cycles Data collection at extension step (60 o C 60 sec) Data collection at extension step (60 o C 60 sec) ROX normalization ROX normalization การตรวจสารพันธุกรรมวิธี REAL- TIME RT-PCR

21

22

23

24

25

26 Standard curve: slope -3.6 ถึง -3.3 efficiency %Standard curve: slope -3.6 ถึง -3.3 efficiency % R 2 > 0.980R 2 > การตรวจสารพันธุกรรมวิธี REAL- TIME RT-PCR Slope R

27 เกณฑ์ตัดสินผลบวก Clear amplification curve Clear amplification curve CT < 40.0 CT < 40.0 delta RN > 0.5 delta RN > 0.5เกณฑ์ตัดสินผลลบ no amplification curve no amplification curve CT > 40.0 CT > 40.0 delta RN < 0.5 delta RN < 0.5 การตรวจสารพันธุกรรมวิธี REAL- TIME RT-PCR

28

29

30

31 รวมจำนวนตรวจ สิงหาคม 2553 ถึง พฤษภาคม 2555 รวมจำนวนตรวจ สิงหาคม 2553 ถึง พฤษภาคม ตัวอย่าง 601 ตัวอย่าง CSF 321 ตัวอย่าง CSF 321 ตัวอย่าง Serum 280 ตัวอย่าง Serum 280 ตัวอย่าง ผลตรวจเป็น Negative ทั้งหมด การตรวจสารพันธุกรรมวิธี REAL- TIME RT-PCR

32 การตรวจแอนติบอดี 1.West Nile Virus IgM Capture ELISA (E-WNV02M) 2.West Nile Virus IgG Indirect ELISA (E-WNV01G) Panbio Panbio

33 Most patients have detectable levels of IgM antibodies 7-8 days after the onset of symptoms. Most patients have detectable levels of IgM antibodies 7-8 days after the onset of symptoms. IgM antibody has been shown to persist for >500 days in approximately 60% of cases. IgM antibody has been shown to persist for >500 days in approximately 60% of cases. Most patients exhibit IgG antibodies 3-4 weeks post infection. Most patients exhibit IgG antibodies 3-4 weeks post infection. การตรวจแอนติบอดี

34

35

36 การตรวจแอนติบอดี พ.ศ ตรวจ 300 ตัวอย่าง ผลบวก WN IgM 74 ตัวอย่าง ผลบวก WN IgM 74 ตัวอย่าง ผลบวก WN IgG 84 ตัวอย่าง ผลบวก WN IgG 84 ตัวอย่าง ผลบวก JE IgM 234 ตัวอย่าง ผลบวก JE IgM 234 ตัวอย่าง ผลบวก DEN IgM 125 ตัวอย่าง ผลบวก DEN IgM 125 ตัวอย่าง ไม่มีตัวอย่างที่ให้ผลบวกเฉพาะ WN IgM/IgG เท่านั้น ไม่มีตัวอย่างที่ให้ผลบวกเฉพาะ WN IgM/IgG เท่านั้น มี cross reactive กับ Japanese encephalitis virus และ Dengue viruses

37 ส่งตัวอย่างตรวจวิธี ELISA ที่ Research Center for Emerging Viral Diseases (RCEVD) มหาวิทยาลัยมหิดล จำนวน 3 ตัวอย่าง ส่งตัวอย่างตรวจวิธี ELISA ที่ Research Center for Emerging Viral Diseases (RCEVD) มหาวิทยาลัยมหิดล จำนวน 3 ตัวอย่าง พบว่ามี cross react กับ JEV และ WN antigen พบว่ามี cross react กับ JEV และ WN antigen ไม่สามารถระบุเชื้อสาเหตุของโรคได้ ไม่สามารถระบุเชื้อสาเหตุของโรคได้ แนะนำให้ตรวจด้วยวิธี Neutralization antibody test แนะนำให้ตรวจด้วยวิธี Neutralization antibody test การตรวจแอนติบอดี

38 การตรวจแอนติบอดี 3. วิธี Indirect immuno-fluorescence test (IIFT)

39

40 การตรวจแอนติบอดี 3. วิธี Indirect immuno-fluorescence test (IIFT, EUROIMMUN) IgM และ IgG ตรวจ 44 ตัวอย่าง IgM และ IgG ตรวจ 44 ตัวอย่าง ผลบวก IgG 20 ตัวอย่าง (+Den IgM/IgG 2 ตย) ผลบวก IgG 20 ตัวอย่าง (+Den IgM/IgG 2 ตย) ผลบวก IgM 1 ตัวอย่าง (JEV infection) ผลบวก IgM 1 ตัวอย่าง (JEV infection) มี cross reactive กับ JEV และ Dengue viruses มี cross reactive กับ JEV และ Dengue viruses

41 สรุป ฝ่ายอาโบไวรัสตรวจสารพันธุกรรมไวรัสเวสต์ไนล์ ช่วง พ.ศ ทั้งหมด 846 ตัวอย่าง เป็น CSF 368 ตัวอย่าง serum 478 ตัวอย่าง ฝ่ายอาโบไวรัสตรวจสารพันธุกรรมไวรัสเวสต์ไนล์ ช่วง พ.ศ ทั้งหมด 846 ตัวอย่าง เป็น CSF 368 ตัวอย่าง serum 478 ตัวอย่าง ตรวจด้วยวิธี RT-PCR 245 ตัวอย่าง ตรวจด้วยวิธี RT-PCR 245 ตัวอย่าง ตรวจด้วยวิธี Real-time RT-PCR 601 ตัวอย่าง ตรวจด้วยวิธี Real-time RT-PCR 601 ตัวอย่าง ผลตรวจสารพันธุกรรมไม่พบการติดเชื้อไวรัสเวสต์ไนล์ ผลตรวจสารพันธุกรรมไม่พบการติดเชื้อไวรัสเวสต์ไนล์ ผลตรวจแอนติบอดีวิธี ELISA และ IIFT พบผลลบปลอมจาก การติดเชื้ออาโบไวรัสอื่นๆเช่น ไวรัสเดงกี ไวรัสเจอี ผลตรวจแอนติบอดีวิธี ELISA และ IIFT พบผลลบปลอมจาก การติดเชื้ออาโบไวรัสอื่นๆเช่น ไวรัสเดงกี ไวรัสเจอี

42 ขอบคุณ Dr. Ichiro Kurane Dr. Jean Paul Gonzalez นางสุรภี อนันตปรีชา นางวลัยลักษณ์ สุขประเสริฐ

43


ดาวน์โหลด ppt การตรวจการติดเชื้อ ไวรัสเวสต์ไนล์ ในประเทศไทย สุมาลี ชะนะมา

งานนำเสนอที่คล้ายกัน


Ads by Google