งานนำเสนอกำลังจะดาวน์โหลด โปรดรอ

งานนำเสนอกำลังจะดาวน์โหลด โปรดรอ

โครงการการใช้ดีเอ็นเอกำกับลักษณะพันธุ์ไม้ไทย : เรื่องการศึกษาความหลากหลายพันธุกรรมฝรั่งพื้นบ้านและพันธุ์การค้า.

งานนำเสนอที่คล้ายกัน


งานนำเสนอเรื่อง: "โครงการการใช้ดีเอ็นเอกำกับลักษณะพันธุ์ไม้ไทย : เรื่องการศึกษาความหลากหลายพันธุกรรมฝรั่งพื้นบ้านและพันธุ์การค้า."— ใบสำเนางานนำเสนอ:

1 โครงการการใช้ดีเอ็นเอกำกับลักษณะพันธุ์ไม้ไทย : เรื่องการศึกษาความหลากหลายพันธุกรรมฝรั่งพื้นบ้านและพันธุ์การค้า

2 1. เตรียม DNA จาก ใบพืช ดีเอ็น เอ

3 2. เพิ่มปริมาณ DNA ในหลอดทดลองโดย เทคนิควิธี RAPD และ AFLP โดยปฎิกิริยา PCR (Polymerase Chain Reaction)

4 เทคนิค RAPD DNA Denture C, 1 min. Primer Annealing 36 0 C, 1 min. Extension 72 0 C, 2 min. PCR 45 รอบ PCR 1 20 รอบ PCR 2 30 รอบ เทคนิค AFLP Gel analysis เปฏิกิริยา PCR 1 ng/ul plant DNA (total DNA) 1 Buffer 0.1 mM dNTPs0.6 uM Primer 0.02 unit/ul Taq DNA polymerase 6 mM MgCl, ใช้ดีเอ็นเอสาย สั้น สุ่มเข้าคู่กับดี เอ็นเอของพืช แล้วจึงเพิ่ม ปริมาณโดย ปฏิกิริยา PCR ตัดดีเอ็นเอพืช ด้วยเอนไซมส์ใน ตำแหน่งจำเพาะ เกก่อนแล้วจึง ใช้ ดีเอ็นเอสายสั้นมา สุ่มเข้าคู่ ก่อนเพิ่ม ปริมาณปฏิกิริยา PCR ดีเอ็นเอ

5 3. วิเคราะห์ผลลายพิมพ์ดีเอ็นเอ (RAPD และ AFLP- markers) ของฝรั่ง ตัวอย่างลายพิมพ์ดีเอ็นเอ (RAPD- markers ) ของฝรั่ง 16 สายต้น

6 Mar ker G V1 GV6GV6 GV7GV7 GV 4 GV 2 GV 16 GV 8 GV 9 GV 10 GV 11 GV 12 GV 13 GV 14 GV 15 G V3 G V5 กลม สาลี่ แป้น สีทอง สาลี่สี ทอง แป้น ยักษ์ เย็น สอง

7 Mar ker GV 1 GV6GV6 GV7GV7 GV 4 GV 2 GV 16 GV8GV8 GV9GV9 GV 10 GV 11 GV 12 GV 13 GV 14 GV 15 GV 19 GV5GV5 กลม สาลี่ แป้น สี ทอง สาลี่สี ทอง แป้น ยักษ์ ขี้น ก

8 กลมสาลี่ 2 แป้นสีทอง 5 แป้นสีทอง 6 แป้นสีทอง 7 แป้นยักษ์ 12 แป้นยักษ์ 13 สาลี่สีทอง 8 สาลี่สีทอง 11 สาลี่สีทอง 9 สาลี่สี ทอง 10 แป้น ยักษ์ 14 แป้นยักษ์ 15 ขี้นกไส้ขาว 25 ขี้นกไส้ขาว 26 ขี้นกไส้ขาว 29 ขี้นกไส้ขาว 27 ขี้นกไส้ขาว 28 กลมสาลี่ 3 แป้นสีทอง 4 ขี้นกไส้แดง 22 ขี้นกไส้แดง 23 ขี้นกไส้ขาว 24 ขี้นกไส้ขาว 17 ขี้นกไส้ขาว 18 ขี้นกไส้ขาว 19 ขี้นกไส้ขาว 20 ขี้นกไส้แดง 21 ใช้ ไพรเมอร์ 13 ชนิดสามารถแยกแยกความแตกต่างระหว่าง พันธุ์ 27 พันธุ์ แล้ววิเคราะห์ความสัมพันธ์จาก ความเหมือนและไม่เหมือน ของ ลายพิมพ์ดีเอ็นเอ

9 4. ขั้นตอนและวิธีการปฏิกิริยา AFLP (Amplified Fragment Length Polymprphism) ลำดับของไพรเมอร์จำนวน 13 หมายเลข ที่ใช้ในการคัดเลือกไพรเมอร์ที่เหมาะสมในการ จำแนกสายพันธุ์ฝรั่ง หมายเลข รหัสไพรเมอร์ 1 OPE-01 8 OPE-15 2 OPE-02 9 OPE-16 3 OPE OPE-17 4 OPE OPE-18 5 OPE OPE-08 6 OPE OPE-11 7 OPE-14

10 1. การเตรียมดีเอ็นเอ 1) ใช้ใบอ่อนของพืชมาสกัดดีเอ็นเอ ตามวิธีกรเดียวกันกับที่ใช้ RAPD ดังกล่าวข้างต้น แล้วปรับปริมาตรที่สกัดได้ทั้งหมดให้ได้ปริมาณ 100 ul. ในสารละลาย TE buffer 2) ปรับให้ได้ความเข้มข้น DNA 200 ng/ul ( ใช้ DNA ที่สกัดได้จากข้อ 1 ประมาณ 2 ul 3) นำดีเอ็นเอเข้มข้น 200 ng/ul มาเตรียมทำปฏิกิริยาการเพิ่มดีเอ็นเอด้วยเทคนิค AFLP 2. ปฏิกิริยา AFLP 2.1 Digestion : ทำการตัดชิ้นส่วนของดีเอ็นเอด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ 2 ชนิด ได้แก่ EcoRl และ Tru9l ด้วยส่วนประกอบของปฏิกิริยาดังนี้ DNA (200 ng/ul)2 ul Tru9l (10 u/ul)0.5 ul 10xBuffer A2 ul dH 2 O15 ul EcoRl (10 u/ul) 0.5 ul ได้ปริมาตรรวมทั้งสิ้น 20 ul นำส่วนผสมทั้งหมดบ่มที่อุณหภูมิ 34 องศาเซลเซียส 2 ชั่วโมง

11 2.2 Ligation : ทำการเชื่อมชิ้นส่วนของดีเอ็นเอด้วย Adaptor ด้วยส่วนประกอบ ของปฏิกิริยาดังนี้ 10x ligase buffer1 ul dH 2 O 6 ul ER Adaptor (5 pmol/ul)1 ul T 4 DNA Ligase (1 u/ul) 1 ul MS Adaptor (50 pmol/ul)1 ul ได้ปริมาตรรวม 10 ul - ใช้ปริมาตรทั้งหมดผสมลงใจส่วนผสมของ digestion อีก 20 ul ได้ปริมาตรรวม 30 ul. - บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส 4 ชั่วโมง - หลังจากนั้นนำมาเช็คผลใน 1% Agarose gel (0.5% TBE buffer) โดยใช้ DNA จากขั้นตอนดังกล่าว 5 ul. ผสมกับ dyn 5 ul. ดังผลการตรวจสอบในภาพที่ 5 - นำมาเจือจางด้วยน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว 10 เท่า (225 ul.) ก่อนทำปฏิกิริยา PCR 2 ขั้นตอน ได้แก่ PCR I และ PCR II

12 2.3 PCR : ทำการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในขั้นตอนที่ 1 เช่นเดียวกับปฏิกิริยา RAPD ใน RAPD แตกต่างที่ ใช้ไพรเมอร์ 2 ชนิดพร้อมกัน ด้วยส่วนประกอบ ของปฏิกิริยาดังนี้ DNA ( จากช่วง ligation ที่เจือจางแล้ว 10 เท่า )10 ul 10x PCR Buffer 5 ul dNTP (1 mM) 10 ul ER-A-Primer (75 ng/ul) 1 ul Ms-C-Primer (75 ng/ul) 1 ul Taq DNA Polymerase (5u/ul)0.2 ul ปริมาตรรวม 27.2 ul - นำส่วนผสมไปทำให้เกิดปฏิกิริยาด้วยเครื่อง PCR ที่ปรับอุณหภูมิและช่วงเวลาเท่ากับ ปฏิกิริยา RAPD ต่างกันตรงที่ PCRI ของ AFLP ใช้จำนวนรอบเพียง 20 รอบ - จากนั้นนำมาเจือจางด้วยน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว 5 เท่า (108.8 ul) ก่อนทำปฏิกิริยา ใน PCRII

13 3. ทำการตรวจผลด้วย Agarose gel และ Acrylamide gel โดยนำผลที่ได้จาก PCRII ผสมกับ Sequencing dyn 10 ul ได้ปริมาตร รวม 30 ul ใช้เพียง 10 ul เพื่อตรวจสอบผล ขั้นต้นก่อน บน 1% Agarose gel ใน 0.5 x TBF Buffer ด้วยเครื่อง Mupid electrophoresis ขับเคลื่อน ด้วยกระแสไฟฟ้าแรงต่ำ 0.5 watt แล้วจึงไป ตรวจผลที่แน่นอนบน 4.5% Acrylamide gel ใน 1 x TBF Buffer โดย เครื่อง Sequencer gel electrophoresis ขับเคลื่อนด้วย กระแส ไฟฟ้าแรงสูง 50 watt ต่อ 1 gel เปรียบเทียบกับ maker Thinx 174 DNA/Hinf I นำเจลที่ได้ไปย้อม ด้วย ซิลเวอร์ เพื่ออ่านผลปฏิกิริยา AFLP

14 4. การย้อมเจลด้วยซิลเวอร์ (Silver staining) 1) Fixed ด้วย 10% Acetic acid นาน 20 นาที ( ใช้ Shaker เขย่า ) 2) ล้างด้วยน้ำกลั่นหรือน้ำกรองนาน 2 นาที 3 ครั้ง 3) ย้อมด้วย 1 g/L Silver nitrate ผสมกับ 37% formaldehyde 1.5 ml/L นาน นาที ในที่มืด 4) ล้างด้วยน้ำกลั่นหรือน้ำกรอง แล้วรีบเทน้ำทิ้งทันที 5) Develop ด้วยสารละลาย developer จนกระทั่งเห็น band ชัดเจนดี แล้วเท developer ทิ้ง ( ส่วนผสมของ developer ประกอบด้วย Sodium carbonate anhydrous 30 g. 10 mg/ml Sodium thiosulfate 250 ul 37% formaldehyde 1.5 ml. ในปริมาตรทั้งหมด 1 lite 6) Fixed ด้วย 10% acetic acid นาน 5 นาที 7) เทกรดอะซิติกทิ้ง แล้วล้างด้วยน้ำกลั่นอีกครั้งหนึ่งจนหมดกรดอะซิติก ( ประมาณ 5 นาที ) 8) นำแผ่นกระจกผึ่งให้แห้ง แล้วจึงอ่านผล

15 Mark er GV 1 GV 6 GV 7 GV 4 GV 2 GV 16 GV 8 GV 9 GV 10 GV 11 GV 12 GV 13 GV 14 GV 15 GV 3 GV 5 กลม สาลี่ แป้นสี ทอง สาลี่สี ทอง แป้น ยักษ์ เย็น สอง พบความแตกต่างของลายพิมพ์ดีเอ็นเอระหว่างสายต้นที่ระบุว่าเป็นพันธุ์เดียวกัน


ดาวน์โหลด ppt โครงการการใช้ดีเอ็นเอกำกับลักษณะพันธุ์ไม้ไทย : เรื่องการศึกษาความหลากหลายพันธุกรรมฝรั่งพื้นบ้านและพันธุ์การค้า.

งานนำเสนอที่คล้ายกัน


Ads by Google