งานนำเสนอกำลังจะดาวน์โหลด โปรดรอ

งานนำเสนอกำลังจะดาวน์โหลด โปรดรอ

การศึกษาเปรียบเทียบผลการ วิเคราะห์ตรวจหา Lactate ใน เลือดด้วยเทคนิค HPLC กับ เทคนิค Enzymatic Assay สำนักงานป้องกันควบคุมโรคที่ 10 เชียงใหม่

งานนำเสนอที่คล้ายกัน


งานนำเสนอเรื่อง: "การศึกษาเปรียบเทียบผลการ วิเคราะห์ตรวจหา Lactate ใน เลือดด้วยเทคนิค HPLC กับ เทคนิค Enzymatic Assay สำนักงานป้องกันควบคุมโรคที่ 10 เชียงใหม่"— ใบสำเนางานนำเสนอ:

1 การศึกษาเปรียบเทียบผลการ วิเคราะห์ตรวจหา Lactate ใน เลือดด้วยเทคนิค HPLC กับ เทคนิค Enzymatic Assay สำนักงานป้องกันควบคุมโรคที่ 10 เชียงใหม่

2 Blood Lactate cyberlab.lh1.ku.ac.th/elearn/faculty/veterin

3 Blood Lactate http://www.vet.ku.ac.th/std/CAI/physio/47/biochem/first_sem/wn/gluconeogenesis_47.ppt#256,1

4 Medical treatment of HIV ARV (Antiretroviral drug) AZT ( ปี 2533) ►HAART ( ปี 2542) 1. Nucleoside analogues reverse transcriptase inhibitors (NRTIs) 2. Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) 3. Protease inhibitors (PI) 4. Nucleotide reverse transcriptase inhibitors (NtRTIs) 5. Fusion inhibitor 6. CCR5 inhibitor www.aidsthai.org

5 สูตรยาสูตรพื้นฐานโดยกรมควบคุม โรค ( ปี 2547) สูตรที่ 1 d4T/AZT +3TC +NVP (GPO-VIR) สูตรที่ 2 d4T/AZT +3TC +EFV สูตรที่ 3 d4T/AZT +3TC +IDV/RTV ทุกสูตรยาประกอบด้วยยาในกลุ่ม NRTIs อยู่ คือ d4T, 3TC, AZT

6 Nucleoside Analogue Reverse Transcriptase Inhibitors (NRTIs) Sanjeev et al., 1999

7 Nikolenko, Galina N. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 2093-2098 NRTI abrogation HIV-1 replication

8 Adverse effect; Lactic acidosis www.gcarlson.com NRTIsInhibit DNA polymerase gamma Inhibit oxidative phosphorylation ► ▼ ▼ Mitochondria toxicity

9 Glucose ▼ Glycolysis ▼ pyruvate fermentation http://www.sc.chula.ac.th/courseware/bio-u2/ppt/b09.ppt#288,33 aerobic cellular respiration

10 ผู้ป่วยที่รับยา NRTIs Asymptomatic hyperlactatemia; prevalence = 15-35% Symptomatic hyperlactatemia; incidence = 13 ราย / 1,000 ราย ต่อปี Severe hyperlactatemia; mortality rate = 57% การตรวจหาแลคเตทในห้องปฏิบัติการ Calza et al., 2005 Falco et al., 2002

11 Lactic acid Chemical name; 2- hydroxypropanoic acid Chemical formula;C 3 H 6 O 3 Molecular mass;90.08 g/mol CAS number;[50-21-5] Melting point;53 ๐ C Boiling point;;122 °C @ 12 mmHg www.wikipedia.org การตรวจหาแลคเตทในห้องปฏิบัติการ ( ต่อ )

12 ปัญหา ตรวจวัดระดับแลคเตท ในเลือด, ส่วนใหญ่ยัง ไม่มี การวินิจฉัยล่าช้า Clinical sign ไม่ จำเพาะ โรงพยาบาลส่วนใหญ่ ใช้ Anion gap Bicarbonate concentration Clinical sign ความต้องการ NRTIs+clinical sign Lactate=2-5 mM ▼ อาการแย่ลง ▼ แก้ไข

13 การแก้ไขปัญหา พัฒนาวิธีตรวจ (HPLC) โดยเปรียบเทียบ กับ enzymatic assay ช่วยเหลือการติดตามดูแลผู้ป่วย ข้อมูล ; ระบบหน่วยงานสาธารณสุข การตรวจหาแลคเตทในห้องปฏิบัติการ ( ต่อ )

14 Lactic acidosis; arterial pH ≤ 7.35, hyperlactatemia HPLC technique Bleiberg et. al,1991 ; isocratic HPLC UV detector, derivatization (serum), calibration curve linearity = 0.18-6.0 mM, analytical recovery = 87% Literature review ( สัญชัย ชาสมบัติและคณะ 2547)

15 HPLC technique Minniti et. al (2001) ; HPLC (gradient), diode array detector, ion exclusion column, mobile phase = sulfuric for HPLC-MS system (serum, CSF) Cheng C et. al (2001), Cheng F et al.(2000) ; UV detector, ion exchange column,mobile phase = sulfonic acid 4mM (dialysates) Literature review (cont.)

16 Hasegawa et. al (2003); column- switching HPLC pre-column fluorescence derivatization (serum) Intra-day and inter-day accuracies = 90.5-101.2 and 89.0-100.7% Literature review (cont.)

17 Objective เปรียบเทียบผลการวิเคราะห์ตรวจหา Lactate ในเลือดด้วยเทคนิค HPLC กับ เทคนิค Enzymatic Assay

18 Research design Develop HPLC method Validate HPLC method เปรียบเทียบวิธีวิเคราะห์ HPLC & Enzymatic assay (Guidance for industry bioanalytical method validation 2001)

19 Sample: 1. Oxalic acid 2. Tartaric acid 3. Formic acid 4. Malic acid 5. Malonic acid 6. Lactic acid 7. Maleic acid 8. Fumaric acid Column: HydroBond AQ C18 4.6 x 250 mm, 5 um Mobile Phase: 0.05M NaH 2 PO 4 99%,acetonitrile 1% pH 2.4 Flow Rate:1.0 mL/min การพัฒนาวิธี HPLC Agilent ZORBAX Column Selection Guide for HPLC 2004

20 การวัดปริมาณแลคเตทด้วยวิธี HPLC

21 การพัฒนาวิธี HPLC เพื่อตรวจวัดปริมาณแลค เตทในเลือด ทดสอบสภาวะที่เหมาะสม Mobile Phase ; NaH 2 PO 4 20 mM pH 2.63, isocratic Flow rate ; 0.8 ml/min Column ; reverse – phase C 18 stable bond, 35 ๐ C Wavelength ; 210 nm Injection volumn ; 100 ul การพัฒนาวิธี HPLC ( ต่อ )

22 Standard lactate HPLC chromatogram HPLC chromatogram Standard lactate 20 mM RT = 3.18 ± 0.25 min

23 Method validation Linearity Sensitivity Specificity Accuracy Precision Reproducibility Stability Freeze & Thaw Stability Short-Term Temperature Stability Long-Term Stability Post-Preparative Stability Guidance for industry bioanalytical method validation 2001

24 Lactate (mM) Peak area (Mean ± S.D.) 1.25 2.50 5.00 7.50 10.00 15.00 1.05 ± 0.05 2.06 ± 0.12 3.53 ± 0.10 5.32 ± 0.09 7.43 ± 0.13 10.75 ± 0.06 Slope = 0.71 Linearity

25 Sensitivity LOD = 0.625 mM LOQ = 1.25 mM Conc. mM Mean ± S.D. Accura cy %CV 0.6250.594 ± 0.093 95.07 % 15.6 5

26 Specificity

27 Specificity (Cont.) propionic acid Lactic acid

28 Area 4.33722 Amount 6.357 mM/L Area 4.09951 Amount 6.02 mM/L Lactic acid Propionic acid Specificity (Cont.) (94.69%)

29 Accuracy; % recovery การทดลองครั้งที่ปริมาณที่เติม 1.25 mM ปริมาณที่เติม 5 mM ปริมาณที่เติม 10 mM 1234512345 3.04 2.73 2.50 2.89 2.42 6.78 7.49 7.12 7.25 7.17 11.71 12.51 12.09 12.27 12.04 Mean2.727.1612.12 S.D.0.26 0.29 %CV9.563.602.40 Expected value3.086.8311.83 % Recovery88.31104.83102.45

30 Intra-day Precision ครั้งที่ ปริมาณแลคเตท (mM) ซีรั่ม QC ระดับ 1 ซีรั่ม QC ระดับ 2 1 2 3 4 5 1.310 1.350 1.320 1.340 1.330 5.590 5.620 5.430 5.580 5.610 mean1.3505.650 S.D.0.0160.077 %CV1.181.36

31 Inter-day Precision

32 การทดลอง ครั้งที่ ปริมาณแลคเตท (mM) ซีรั่ม QC ระดับ 1 ซีรั่ม QC ระดับ 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1.41 1.40 1.35 1.42 1.38 1.36 1.41 1.45 1.42 5.83 6.15 5.35 6.36 5.14 5.80 5.77 5.48 5.85 mean1.405.73 S.D.0.060.36 %CV2.076.26

33 Stability ครั้งที่ ปริมาณแลคเตทที่ตรวจวัดได้ (mM) Mean ± S.D. NaF - OX tube EDTA tube 1 2(day 3) 3(day 7) 4(day 14) 1.16 ± 0.09 1.65 ± 0.09 1.33 ± 0.26 1.38 ± 0.02 1.33 ± 0.07 2.04 ± 0.10 2.09 ± 0.10 2.85 ± 0.09 Collecting tube

34 ครั้งที่ปริมาณแลคเตทจาก ตัวอย่างที่มีค่าปกติ (mM) Mean ± S.D. ปริมาณแลคเตทจาก ตัวอย่างที่มีค่าสูง (mM) Mean ± S.D. 01230123 1.16 ± 0.07 1.39 ± 0.03 0.87 ± 0.09 0.84 ± 0.03 12.69 ± 0.05 11.76 ± 0.59 11.13 ± 0.26 10.20 ± 0.41 Freeze & Thaw Stability: 3 cycles Stability (cont.)

35 Stability (Cont.) Short-Term Temperature Stability ครั้งที่ปริมาณแลคเตทจาก ตัวอย่างที่มีค่าปกติ (mM) Mean ± S.D. ปริมาณแลคเตทจาก ตัวอย่างที่มีค่าสูง (mM) Mean ± S.D. 1234512345 1.16 ± 0.09 1.47 ± 0.04 1.43 ± 0.07 1.37 ± 0.04 1.48 ± 0.05 12.69 ± 0.05 11.63 ± 0.53 12.41 ± 1.04 13.34 ± 0.69 12.69 ± 0.05

36 Stability (Cont.) Long-Term Stability ครั้งที่ปริมาณแลคเตทจาก ตัวอย่าง ที่มีค่าปกติ (mM) Mean ± S.D. ปริมาณแลคเตทจาก ตัวอย่าง ที่มีค่าสูง (mM) Mean ± SD. 12341234 1.16 ± 0.09 1.65 ± 0.09 1.33 ± 0.26 1.38 ± 0.02 12.69 ± 0.05 12.29 ± 0.43 11.34 ± 0.25 12.04 ± 0.49 mean1.3812.09 S.D.0.200.57 %CV14.494.7

37 Stability (Cont.) Post Preparative Stability ครั้งที่ปริมาณแลคเตท จากตัวอย่างที่มี ค่าปกติ (mM) Mean ± S.D. ปริมาณแลคเตท จากตัวอย่างที่มี ค่าสูง (mM) Mean ± S.D. 1 2 (2 hr) 3 (4 hr) 1.38 ± 0.02 1.71 ± 0.08 1.76 ± 0.09 8.52 ± 0.09 11.57 ± 1.07 13.11 ± 0.74

38 ตัวอย่างเลือด ตัวอย่างเลือดที่เหลือจากงานบริการที่จะใช้ เปรียบเทียบวิธีวิคราะห์แลคเตท จำนวน 30 ตัวอย่าง

39 Enzymatic assay www.gmi-inc.com McLellan et al (1992)

40 Result (HPLC & Enzymatic assay) กลุ่มที่ 1 Normal ( ต่ำกว่า 2 mmol/L) จำนวน 9 ราย 1.52 ± 0.34 mmol/L & 1.45 ± 0.24 mmol/L กลุ่มที่ 2 Moderate hyperlactatemia (2-5 mmol/L) จำนวน 12 ราย 3.38 ± 0.88 mmol/L & 3.08 ± 0.71 mmol/L กลุ่มที่ 3 Severe hyperlactatemia (> 5 mmol/L) จำนวน 9 ราย 8.44 ± 2.44 mmol/L & 9.65 ± 2.69 mmol/L

41 Comparison of developed HPLC & Enzymaic assay Pearson correlation; r = 0.93

42 4.204.74 P < 0.05 Comparison of developed HPLC & Enzymaic assay

43 HPLCEnzymatic assay Accuracy99.38%91.10% Precision4.76%6.82% ReagentLOW COSTHIGH COST Expire dateLongShort

44 Conclusion Validation of developed HPLC for Lactate ► good accuracy & precision Utility

45 Acknowledgement กรมควบคุมโรค ภาควิชานิติเวช คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ หน่วยปฏิบัติการเคมีคลินิก คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์สุขภาพ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ สำนักงานป้องกันควบคุมโรคที่ 10 เชียงใหม่

46 Thank you for attention

47

48 Sample collection and handling Subject; After overnight fast (12 h) ▼ Blood sample 4 ml (fluoride oxalate tube) relax the hand, unclenching ▼ Centrifuge, freez ▼ deproteinize

49 Lactic acid fermentation (animal cell)cell) www.il.mahidol.ac.th/.../L2T1_new.html

50 HPLC

51 Enzymatic Assay 20 15 10 5 0 T Test (p < 0.01) Lactate (mmol/L)

52 Samp 9 Samp 7 Samp 4

53 Samp26 Samp28 Samp 33

54 %recovery 10 mM Spike1:40 25:1000 5 mM spike 1.25 mM spike SampleSTD 400, 200, 50 mM STD25 ul 400 mM/L 25 ul 200 mM/L 25 ul 50 mM/L -25 ul D.W.25 ul500 plasma500 - Ac475

55 Inter-day Precision (10 days) QC level 2 (4.5-6.74 mM) QC level 1 (1.17-1.75 mM) SpectroHPLCSpectroHPLC 27 days10 days27 days10 days 5.122.14106(5.73)1.690.595697 (1.40) mean 0.330.3590.050.06SD 6.446.262.962.07%CV 91.1101.96%115.7595.89%accurac y

56 Intra-day Precision QC level 2 (4.5-6.74 mM) HPLC spectro. QC level 1 (1.17-1.75 mM) HPLC spectro. Day 1 (mean) Day 2 (mean) Day 3 (mean) Day 4 (mean) Day 5 (mean) 4.98 5.23 4.92 5.08 4.35 2.092777 (5.59) 2.180323 (5.84) 2.076177 (5.52) 2.160931 (5.78) 2.065659 (5.51) 1.62 1.64 1.66 1.68 0.585947 (1.31) 0.601614 (1.36) 0.584541 (1.31) 0.608000 (1.37) 0.614768 (1.39) 4.912.17729 (5.65)1.65 0.598574(1.35 ) Mean (5 days) 0.335 (0.152)0.022 0.013(0.036) SD 6.82 (2.69)1.33 2.17(2.67) %CV 87.37%100.53%113.01%92.46%accuracy

57 การใช้สารยับยั้งการสลายตัวของน้ำตาล enzymeCoenzyme or activatorInhibitors Glucose-6-phosphataseMg ++ Citrate PhosphofructokinaseMg ++, ADP, AMP, PATP, Citrate Diphosphofructose phosphatase Mg ++, ATPF -, AMP Phosphoglyceraldehyde dehydrogenase DPN + Iodoacetate EnolaseMg ++, Mn ++ F -, PPi, Ca ++ Pyruvic acid kinaseMg ++, K +, fructose 1,6- diphosphate Ca ++ Lactic acid dehydrogenaseDPN + Oxalate นันทยา, อุดมศักดิ์ (2524)

58 Lactic acid fermentation (animal cell) http://www.sc.chula.ac.th/courseware/bio-u2/ppt/b09.ppt#288,33, ภาพนิ่ง 33

59 Astles R. et al (1994)

60 Interference of F and OX Astles R. et al (1994)

61

62

63


ดาวน์โหลด ppt การศึกษาเปรียบเทียบผลการ วิเคราะห์ตรวจหา Lactate ใน เลือดด้วยเทคนิค HPLC กับ เทคนิค Enzymatic Assay สำนักงานป้องกันควบคุมโรคที่ 10 เชียงใหม่

งานนำเสนอที่คล้ายกัน


Ads by Google