สำนักงานป้องกันควบคุมโรคที่ 10 เชียงใหม่

งานนำเสนอเรื่อง: "สำนักงานป้องกันควบคุมโรคที่ 10 เชียงใหม่"— ใบสำเนางานนำเสนอ:

1 สำนักงานป้องกันควบคุมโรคที่ 10 เชียงใหม่
การศึกษาเปรียบเทียบผลการวิเคราะห์ตรวจหา Lactate ในเลือดด้วยเทคนิค HPLC กับ เทคนิค Enzymatic Assay

2 Blood Lactate cyberlab.lh1.ku.ac.th/elearn/faculty/veterin

3 Blood Lactate

4 Medical treatment of HIV
ARV (Antiretroviral drug) AZT (ปี 2533) ►HAART (ปี 2542) 1. Nucleoside analogues reverse transcriptase inhibitors (NRTIs) 2. Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) 3. Protease inhibitors (PI) 4. Nucleotide reverse transcriptase inhibitors (NtRTIs) 5. Fusion inhibitor 6. CCR5 inhibitor

5 สูตรยาสูตรพื้นฐานโดยกรมควบคุมโรค(ปี 2547)
สูตรที่ 1 d4T/AZT +3TC +NVP (GPO-VIR) สูตรที่ 2 d4T/AZT +3TC +EFV สูตรที่ 3 d4T/AZT +3TC +IDV/RTV ทุกสูตรยาประกอบด้วยยาในกลุ่ม NRTIs อยู่ คือ d4T, 3TC, AZT

6 Nucleoside Analogue Reverse Transcriptase Inhibitors (NRTIs)
Sanjeev et al., 1999

7 NRTI abrogation HIV-1 replication
Nikolenko, Galina N. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102,

8 Adverse effect; Lactic acidosis
NRTIs ► Inhibit DNA polymerase gamma ▼ Inhibit oxidative phosphorylation ▼ Mitochondria toxicity

9 Glucose Glycolysis pyruvate ▼
fermentation aerobic cellular respiration

10 การตรวจหาแลคเตทในห้องปฏิบัติการ
ผู้ป่วยที่รับยา NRTIs Asymptomatic hyperlactatemia; prevalence = 15-35% Symptomatic hyperlactatemia; incidence = 13 ราย/ 1,000 รายต่อปี Severe hyperlactatemia; mortality rate = 57% Calza et al., 2005 Falco et al., 2002

11 การตรวจหาแลคเตทในห้องปฏิบัติการ (ต่อ)
Lactic acid Chemical name ; 2-hydroxypropanoic acid Chemical formula ; C3H6O3 Molecular mass ; g/mol CAS number ; [ ] Melting point ; 53๐C Boiling point ; ; mmHg

12 การตรวจหาแลคเตทในห้องปฏิบัติการ (ต่อ)
ความต้องการ NRTIs+clinical sign Lactate=2-5 mM ปัญหา ตรวจวัดระดับแลคเตทในเลือด, ส่วนใหญ่ยังไม่มี การวินิจฉัยล่าช้า Clinical sign ไม่จำเพาะ โรงพยาบาลส่วนใหญ่ใช้ Anion gap Bicarbonate concentration Clinical sign ▼ อาการแย่ลง ▼ แก้ไข

13 การตรวจหาแลคเตทในห้องปฏิบัติการ (ต่อ)
การแก้ไขปัญหา พัฒนาวิธีตรวจ (HPLC) โดยเปรียบเทียบกับ enzymatic assay ช่วยเหลือการติดตามดูแลผู้ป่วย ข้อมูล; ระบบหน่วยงานสาธารณสุข

14 Literature review Lactic acidosis; arterial pH ≤ 7.35, hyperlactatemia
HPLC technique Bleiberg et. al,1991 ; isocratic HPLC UV detector, derivatization (serum), calibration curve linearity = mM, analytical recovery = 87% (สัญชัย ชาสมบัติและคณะ 2547)

15 Literature review (cont.)
HPLC technique Minniti et. al (2001) ; HPLC (gradient), diode array detector, ion exclusion column, mobile phase = sulfuric for HPLC-MS system (serum, CSF) Cheng C et. al (2001), Cheng F et al.(2000) ; UV detector, ion exchange column,mobile phase = sulfonic acid 4mM (dialysates)

16 Literature review (cont.)
Hasegawa et. al (2003); column-switching HPLC pre-column fluorescence derivatization (serum) Intra-day and inter-day accuracies = and %

17 Objective เปรียบเทียบผลการวิเคราะห์ตรวจหา Lactate ในเลือดด้วยเทคนิค HPLC กับ เทคนิค Enzymatic Assay

18 Research design Develop HPLC method Validate HPLC method
เปรียบเทียบวิธีวิเคราะห์ HPLC & Enzymatic assay (Guidance for industry bioanalytical method validation 2001)

19 การพัฒนาวิธี HPLC Column: HydroBond AQ C x 250 mm, 5 um       Mobile Phase: 0.05M NaH2PO4 99%,acetonitrile 1% pH 2.4 Flow Rate:1.0 mL/min Sample: 1. Oxalic acid 2. Tartaric acid 3. Formic acid 4. Malic acid 5. Malonic acid 6. Lactic acid 7. Maleic acid 8. Fumaric acid Agilent ZORBAX Column Selection Guide for HPLC 2004

20 การวัดปริมาณแลคเตทด้วยวิธี HPLC

21 การพัฒนาวิธี HPLC (ต่อ)
ทดสอบสภาวะที่เหมาะสม Mobile Phase ; NaH2PO4 20 mM pH 2.63, isocratic Flow rate ; ml/min Column ; reverse – phase C18 stable bond, 35๐C Wavelength ; nm Injection volumn ; ul

22 Standard lactate HPLC chromatogram
Standard lactate 20 mM RT = 3.18 ± 0.25 min

23 Method validation Linearity Sensitivity Specificity Accuracy Precision
Reproducibility Stability Freeze & Thaw Stability Short-Term Temperature Stability Long-Term Stability Post-Preparative Stability Guidance for industry bioanalytical method validation 2001

24 Linearity Lactate (mM) Peak area (Mean ± S.D.) 1.25 2.50 5.00 7.50
10.00 15.00 1.05 ± 0.05 2.06 ± 0.12 3.53 ± 0.10 5.32 ± 0.09 7.43 ± 0.13 10.75 ± 0.06 Linearity Slope = 0.71

25 Sensitivity Conc. mM Mean ± S.D. Accuracy %CV 0.625 0.594 ± 0.093
95.07% 15.65 LOD = mM LOQ = 1.25 mM

26 Specificity

27 Specificity (Cont.) propionic acid Lactic acid propionic acid

28 Specificity (Cont.) Area 4.33722 Amount 6.357 mM/L Area 4.09951
Lactic acid Area Amount 6.02 mM/L (94.69%) Propionic acid Lactic acid

29 Accuracy; % recovery การทดลองครั้งที่ ปริมาณที่เติม1.25 mM
3 4 5 3.04 2.73 2.50 2.89 2.42 6.78 7.49 7.12 7.25 7.17 11.71 12.51 12.09 12.27 12.04 Mean 2.72 7.16 12.12 S.D. 0.26 0.29 %CV 9.56 3.60 2.40 Expected value 3.08 6.83 11.83 % Recovery 88.31 104.83 102.45

30 Intra-day Precision ครั้งที่ ปริมาณแลคเตท (mM) ซีรั่ม QC ระดับ 1
2 3 4 5 1.310 1.350 1.320 1.340 1.330 5.590 5.620 5.430 5.580 5.610 mean 5.650 S.D. 0.016 0.077 %CV 1.18 1.36

31 Inter-day Precision

32 การทดลองครั้งที่ ปริมาณแลคเตท (mM) ซีรั่ม QC ระดับ 1 ซีรั่ม QC ระดับ 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1.41 1.40 1.35 1.42 1.38 1.36 1.45 5.83 6.15 5.35 6.36 5.14 5.80 5.77 5.48 5.85 mean 5.73 S.D. 0.06 0.36 %CV 2.07 6.26

33 ปริมาณแลคเตทที่ตรวจวัดได้ (mM)
Stability Collecting tube ครั้งที่ ปริมาณแลคเตทที่ตรวจวัดได้ (mM) Mean ± S.D. NaF - OX tube EDTA tube 1 2(day 3) 3(day 7) 4(day 14) 1.16 ± 0.09 1.65 ± 0.09 1.33 ± 0.26 1.38 ± 0.02 1.33 ± 0.07 2.04 ± 0.10 2.09 ± 0.10 2.85 ± 0.09

34 Stability (cont.) Freeze & Thaw Stability: 3 cycles ครั้งที่
ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่างที่มีค่าปกติ (mM) Mean ± S.D. ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่างที่มีค่าสูง(mM) 1 2 3 1.16 ± 0.07 1.39 ± 0.03 0.87 ± 0.09 0.84 ± 0.03 12.69 ± 0.05 11.76 ± 0.59 11.13 ± 0.26 10.20 ± 0.41

35 Stability (Cont.) Short-Term Temperature Stability ครั้งที่
ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่างที่มีค่าปกติ (mM) Mean ± S.D. ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่างที่มีค่าสูง (mM) 1 2 3 4 5 1.16 ± 0.09 1.47 ± 0.04 1.43 ± 0.07 1.37 ± 0.04 1.48 ± 0.05 12.69 ± 0.05 11.63 ± 0.53 12.41 ± 1.04 13.34 ± 0.69

36 ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่าง
Stability (Cont.) Long-Term Stability ครั้งที่ ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่าง ที่มีค่าปกติ (mM) Mean ± S.D. ที่มีค่าสูง (mM) Mean ± SD. 1 2 3 4 1.16 ± 0.09 1.65 ± 0.09 1.33 ± 0.26 1.38 ± 0.02 12.69 ± 0.05 12.29 ± 0.43 11.34 ± 0.25 12.04 ± 0.49 mean 1.38 12.09 S.D. 0.20 0.57 %CV 14.49 4.7

37 ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่างที่มีค่าปกติ ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่างที่มีค่าสูง
Stability (Cont.) Post Preparative Stability ครั้งที่ ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่างที่มีค่าปกติ (mM) Mean ± S.D. ปริมาณแลคเตทจากตัวอย่างที่มีค่าสูง 1 2 (2 hr) 3 (4 hr) 1.38 ± 0.02 1.71 ± 0.08 1.76 ± 0.09 8.52 ± 0.09 11.57 ± 1.07 13.11 ± 0.74

38 ตัวอย่างเลือด ตัวอย่างเลือดที่เหลือจากงานบริการที่จะใช้เปรียบเทียบวิธีวิคราะห์แลคเตท จำนวน 30 ตัวอย่าง

39 Enzymatic assay McLellan et al (1992)

40 Result (HPLC & Enzymatic assay)
กลุ่มที่ 1 Normal (ต่ำกว่า 2 mmol/L) จำนวน 9 ราย 1.52 ± 0.34 mmol/L & 1.45 ± 0.24 mmol/L กลุ่มที่ 2 Moderate hyperlactatemia (2-5 mmol/L) จำนวน 12 ราย 3.38 ± 0.88 mmol/L & 3.08 ± 0.71 mmol/L กลุ่มที่ 3 Severe hyperlactatemia (> 5 mmol/L) จำนวน 9 ราย 8.44 ± 2.44 mmol/L & 9.65 ± 2.69 mmol/L

41 Comparison of developed HPLC & Enzymaic assay
Pearson correlation; r = 0.93

42 Comparison of developed HPLC & Enzymaic assay
4.20 4.74 P < 0.05

43 Comparison of developed HPLC & Enzymaic assay
Enzymatic assay Accuracy 99.38% 91.10% Precision 4.76% 6.82% Reagent LOW COST HIGH COST Expire date Long Short

44 Conclusion Validation of developed HPLC for Lactate ► good accuracy & precision Utility

45 Acknowledgement กรมควบคุมโรค
ภาควิชานิติเวช คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ หน่วยปฏิบัติการเคมีคลินิก คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์สุขภาพ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ สำนักงานป้องกันควบคุมโรคที่ 10 เชียงใหม่

46 Thank you for attention

47

48 Sample collection and handling
Subject; After overnight fast (12 h) ▼ Blood sample 4 ml (fluoride oxalate tube) relax the hand, unclenching Centrifuge, freez deproteinize

49 Lactic acid fermentation (animal cell)

50 HPLC

51 HPLC Enzymatic Assay 20 15 10 5 T Test (p < 0.01) Lactate (mmol/L)

52 Samp 7 Samp 9 Samp 4

53 Samp26 Samp28 Samp 33

54 %recovery 10 mM Spike1:40 25:1000 5 mM spike 1.25 mM Sample STD
25 ul 400 mM/L 200 mM/L 50 mM/L - D.W. 500 plasma Ac 475

55 Inter-day Precision (10 days)
QC level 2 ( mM) QC level 1 ( mM) Spectro HPLC 27 days 10 days 5.12 (5.73) 1.69 (1.40) mean 0.33 0.359 0.05 0.06 SD 6.44 6.26 2.96 2.07 %CV 91.1 101.96% 115.75 95.89% accuracy

56 Intra-day Precision QC level 2 (4.5-6.74 mM) HPLC spectro. QC level 1
Day (mean) Day (mean) Day (mean) Day (mean) Day (mean) 4.98 5.23 4.92 5.08 4.35 (5.59) (5.84) (5.52) (5.78) (5.51) 1.62 1.64 1.66 1.68 (1.31) (1.36) (1.31) (1.37) (1.39) 4.91 (5.65) 1.65 (1.35) Mean (5 days) 0.335 (0.152) 0.022 0.013(0.036) SD 6.82 (2.69) 1.33 2.17(2.67) %CV 87.37% 100.53% 113.01% 92.46% accuracy

57 การใช้สารยับยั้งการสลายตัวของน้ำตาล
enzyme Coenzyme or activator Inhibitors Glucose-6-phosphatase Mg++ Citrate Phosphofructokinase Mg++, ADP, AMP, P ATP, Citrate Diphosphofructose phosphatase Mg++, ATP F-, AMP Phosphoglyceraldehyde dehydrogenase DPN+ Iodoacetate Enolase Mg++, Mn++ F-, PPi, Ca++ Pyruvic acid kinase Mg++, K+, fructose 1,6-diphosphate Ca++ Lactic acid dehydrogenase Oxalate นันทยา, อุดมศักดิ์ (2524)

58 Lactic acid fermentation (animal cell)
33

59 Astles R. et al (1994)

60 Interference of F and OX
Astles R. et al (1994)

61

62

63