งานนำเสนอกำลังจะดาวน์โหลด โปรดรอ

งานนำเสนอกำลังจะดาวน์โหลด โปรดรอ

1. 2 Gene Engineering  การสร้าง gene ใหม่  โดยตัดต่อระหว่าง DNA จาก แหล่งที่ต่างกัน  ได้ DNA โมเลกุลใหม่ เป็น โมเลกุลผสม เรียกว่า Recombinant DNA 

งานนำเสนอที่คล้ายกัน


งานนำเสนอเรื่อง: "1. 2 Gene Engineering  การสร้าง gene ใหม่  โดยตัดต่อระหว่าง DNA จาก แหล่งที่ต่างกัน  ได้ DNA โมเลกุลใหม่ เป็น โมเลกุลผสม เรียกว่า Recombinant DNA "— ใบสำเนางานนำเสนอ:

1 1

2 2 Gene Engineering  การสร้าง gene ใหม่  โดยตัดต่อระหว่าง DNA จาก แหล่งที่ต่างกัน  ได้ DNA โมเลกุลใหม่ เป็น โมเลกุลผสม เรียกว่า Recombinant DNA  วิธีการทำหรือ methodology เรียกว่า Recombinant DNA technology หรือ Genetic engineering หรือ Gene cloning

3 3  I. หลักการ Recombinant DNA (Gene cloning)  II. ส่วนประกอบในการทำ gene cloning  III. การประยุกต์ใช้ Gene cloning

4 4 I. หลักการทำ Recombinant DNA 1. แยก DNA ของพาหะ และ DNA ที่ ต้องการทำ cloning 2. ตัด DNA ของทั้ง 2 แหล่งด้วย Restriction endonuclease 3. ผสม DNA ทั้ง 2 แหล่ง กับ DNA ligase ภายใต้ เงื่อนใขให้ DNAs ต่อกัน --> ได้ Recombinant DNA หรือ Chimeric DNA

5 5 การสร้าง Recombinant DNA

6 6 II. ส่วนประกอบของการทำ Gene Cloning 1. Gene ที่ต้องการศึกษา เรียกว่า foreign DNA 2. DNA พาหะ เรียว่า Vector DNA 3. Restriction endonuclease 4. DNA ligase ต่อระหว่าง 2 nucleotides 5. Host cells สำหรับ recombinant DNA เพื่อเพิ่มจำนวนในขั้นต้นของ กระบวนการ ที่พัฒนาใช้ได้แล้วมี bacteria บางชนิด และ yeast

7 7 ขั้นตอนละเอียดในการทำ Gene cloning 1. เลือก DNA โมเลกุลที่ต้องการ clone เรียกว่า Foreign DNA และเลือก DNA โมเลกุลที่ นำหน้าที่เป็นพาหะ เรียกว่า Vector DNA  ตัด foreign DNA และ ตัด vector DNA ด้วย enzyme ชนิดเดียวกัน Enzyme ที่ใช้ เรียกว่า Restriction enzyme ( แยกคนละหลอด )

8 8 2. เลือกท่อน (fragment) ของ cut foreign DNA ขนาดพอเหมาะที่จะ clone โดย  แยก DNA ในแผ่นวุ้น ใน สนามไฟฟ้า เรียกวิธีนี้ว่า Electrophoresis ซึ่ง DNA จะถูก ออกจากกันตามขนาดความยาว ได้ ปรากฏเป็นแถบ (bands) ต่าง ๆ กัน  ตัดและแยกแถบที่ต้องการออกมา สกัดแยก DNA ท่อน (fragment) ที่ ต้องการ

9 9 DNA gel electroph oresis สำหรับ แยก ชิ้นส่วน DNA

10 10 3. Insert DNA fragment เข้าไปใน โมเลกุลของ cut vector DNA ด้วย enzyme Ligase จะได้ DNA ผสม โมเลกุลใหม่ เรียกว่า Chimeric DNA หรือ Recombinant DNA 4. นำ Recombinant DNA เข้าไปใน host cells ของ cloning vector โดยวิธี Transformation หรือ วิธีอื่น ๆ host cells โดยทั่วไปใช้ E. coli และ yeast 5. Recombinant DNA ภายใน host จะแบ่งตัวเพิ่มจำนวน เรียกว่า Amplification และถ่ายทอดไป พร้อมกับการแบ่งตัวเพิ่มจำนวน ของ host ทำให้ได้ identical copies หรือ clones ของ recombinant DNA จำนวนมาก

11 11  หลักการ พื้นฐานของ Gene cloning  Clone หมายถึง ประชากร (copy) ที่ เหมือนกัน ของ สิ่งมีชีวิต หรือ โมเลกุล

12 12 6. ทำการตรวจเลือกหา (screening) host cells มี recombinant DNA

13 13 Cloning Vectors 1. Plasmid 2. Bacteriophage 3. Cosmid 4. Phagemid 5. Artificial chromosome

14 14 1. Plasmid vectors Plasmids  เป็น extrachromosome ใน microorganisms โดยเฉพาะ bacteria  เป็น double-stranded circular โมเลกุล  ขนาด ~ 1 kb (1 kb = 1000 bp) ถึง 200 kb  มี antibiotic-resistant genes ที่ สามารถใช้เป็น markers สำหรับคัดเลือก clones ที่ positive  pBR322 เป็น plasmid ตัวแรกที่ใช้ ใน cloning

15 Plasmid pBR322  ขนาด 4.3 Kb  มี Ampicillin resisteant gene Tetracyclin resistant gene  มี restriction sites มาก และ ง่ายต่อการใช้ทำ cloning เช่น EcoRI, PstI, BamHI  มี Origin of replication  เป็น cloning vector ใน prokaryote  นำเข้า bacteria โดย Transformation

16 16  Bacteri al clonin g โดย ใช้ plasmi d pBR32 2

17 17  ดัดแปลงจาก 2 um plasmid ( พิเศษ ) ของ yeast  ขนาด 6 kb  มี resistant gene ต่อ inhibitors เช่น copper และ methotrexate  marker คือ leu2 gene  ใช้เป็น cloning vector ใน eukaryote  Transform yeast 1.2 Yeast episomal plasmids / YEps

18 18  Yeast cloni ng โดย ใช้ plas mid ที่มี LEU2 gene เป็น mark er

19 19  Ti plasmid หรือ T-DNA ใน Agrobacterium tumefaciens ใน ดิน  integrate เข้า plant chromosomal DNA  ทำให้เกิดเนื้องอกในพืช (callus) หรือ cancer growth หรือ crown gall ในพืช 1.3 Ti plasmid

20 20  Gene cloning โดยใช้ Ti plasmid  เพื่อให้ T- DNA (tumor DNA) ใน bacteria infect ( แทรก ) เข้า chromoso me ของพืช --> crown gall --> ชัก นำให้เจริญ เป็นต้นพืช

21 21 2. Bacteriophage vectors  Double-stranded virus ที่บางระยะ ของวงจรชีวิตอยู่ในรูป Linear duplex  ส่วนมากใช้ Bacteriophage Lambda ( ) ขนาด ~ 50 kb  มี genes ~ 50 % อยู่ 2 ข้างของ linear duplex ที่จำเป็นต่อ growth  บริเวณกลางไม่จำเป็นต่อ growth สามารถตัดออกได้  package DNA ให้เป็น circular form ได้ %

22 22  การใช้ phage เป็น cloning vector  ส่วนกลาง เป็นส่วนที่ไม่ จำเป็นใน การดำรง ชีพของ phage จึง สามารถเอา foreign DNA ใส่เข้า ไปแทนได้ co s coscos

23 23  ใน Linear duplex ที่บริเวณปลายสุด ทั้ง 2 ข้างของเส้นเป็นช่วง Single strand ขนาด 12 nucleotides เรียกว่า Cohesive ends หรือ COS sites  Cos sites ทำ complementary ต่อ กัน ให้ได้ circular duplex DNA ก่อน pack เข้า capsule กลายเป็น bacteriophage ใหม่  vector รับ insert ได้ % จึงเหมาะสำหรับในการทำ cloning ของ eukaryotic genes ซึ่งส่วนมีขนาดใหญ่ เช่น ใช้ทำ Genomic library

24 M13 vector  Single-stranded phage  รับ insert ที่เป็น single-stranded DNA ระหว่าง bases  Rolling circle replication ให้ double strand  ออกจาก bacteria ในรูป single strand  เหมาะสำหรับใช้ cloning เพื่อ sequence DNA

25 25 3. Cosmid vector Vector ที่สร้าง (construct) จากส่วน ของ 1. Plasmid : drug-resistant marker, origin of replication และ restriction sites จึงมี replication ได้เหมือน plasmid 2. Phage : cos sites สำหรับ packaging cloned DNA ให้เป็น phage chromosome ใน in vtro

26 26  cosmid มีขนาด 4-6 kb  construct ให้มี polycloning site  cosmid สามารถ รับ insert foreign DNA ได้ ระหว่าง kb  เหมาะในการ clone gene ขนาดใหญ่ของ eukaryote

27 27 4. Pagemid vector  Vector ที่ construct ให้มี คุณลักษณะคล้าย cosmid คือ มีทั้ง ลักษณะของ phage และ plasmid  มี multiple cloning site insert เข้า ที่ lacZ gene  มี origin of replication จาก single-stranded f1 คล้าย M13 ทำ ให้ package ได้ single-stranded phagemid DNA

28 28  Bluescript vector / pBS ใช้เป็น Transcription vector  มี Multiple cloning site  มี 2 promoters คือ  T3 promoter ข้างหนึ่ง และ  T7 promoter อีกข้างหนึ่ง  สามารถ transcribe RNA ใน in vitro  ใช้ศึกษา translation in vitro

29 29 5. Artificial chromosome  เป็น Construct เพี่อทำ cloning ใน yeast เรียกว่า Yeast Artificial chromosome / YAC  เป็น mini-chromosome ประกอบด้วย  1 centromere, 2 telomeres, origin of replication, และ seletable marker gene(s)  ใช้ศึกษา chromosome segregation ระหว่าง meiosis และ cloning DNA ขนาดใหญ่ได้ถึง 150 kb

30 30 Yeast Artificial chromosome / YAC

31 31 Restriction Endonuclease  recognize specific nucleotide sequences  ตัดระหว่าง 4-8 nucleotide ลำดับ เฉพาะแต่ละชนิด

32 32  Resstri ction enzym es ตัด DNA ให้ ปลาย 2 แบบ  Blunt end  Sticky end

33 33 DNA ligase  เชื่อมต่อ ระหว่าง 2 nucleotide ของ 2 DNA โมเลกุล  Sticky ends : efficiency ค่อนข้างดี  Blunt ends : efficiency น้อยกว่า

34 34

35 35 DNA library  คือ ห้องสมุด หรือ sets ของ cloned DNA ใน vectors ที่เก็บไว้ ทั้งหมดใน host cells เพื่อใช้ ตรวจหาและศึกษา genes ภายหลัง  แบ่งเป็น 3 ประเภท 1. Genomic DNA library : ห้องสมุด cloned DNA ของ 1 genome ซึ่ง คือ genes ทั้งหมดของ สิ่งมีชีวิตใด ๆ เช่น human genome library 2. cDNA library : ห้องสมุด cloned cDNA ของ structural gene ใด ๆ 3. Chromosome-specific DNA library : ห้องสมุด cloned DNA ของ 1 chromosome

36 36

37 37 Application ของ Gene Recombinant Technology 1. Physical maps / restriction maps of DNA molecule หาแผนผังตำแหน่งของ gene บน chromosomes 2. Nucleotide sequences of gene หาลำดับ base ของ gene 3. In vitro site-specific mutagenesis ศึกษาการทำงาน และการควบคุม ของ genes โดย การทำ mutation เฉพาะ base(s)

38 38 4. Identification of genes ชี้บอก gene และรายละเอียดของ gene เช่น gene ที่ทำให้เป็นโรค 5. Human gene therapy รักษาโรคทางพันธุกรรม โดยหลัง วิเคราะห์ได้ว่า gene ใดเป็นเหตุของ โรค นำ gene หรือผลผลิต (protein) ของ gene นั้นใส่หรือใช้ทดแทน ป้องกันโดยไม่ให้ gene(s) เป็น สาเหตุของโรครุนแรงถ่ายถอด

39 39 6. Production of proteins ผลิต proteins, hormones และ enzymes ใช้ bacteria ซึ่งเป็น host ของ recombinant DNA เป็นผู้ผลิต ให้ โดยไม่ต้องสกัดจากสิ่งมีชีวิต ชั้นสูงโดยเฉพาะสัตว์ 7. Transgenic organisms (plants & animals) หรือ GMO (Gene modified organism) crown gall, herbicide และ insecticide resistant plants เช่น ข้าว ข้าวโพด ถั่วเหลือง มะเขือเทศ มันฝรั่ง หนู ( ทดลอง ) ฯลฯ 9. Paternity tests & forensic application DNA fingerprints หาความเป็นพ่อ - แม่ หาคนร้าย

40 40 ตัวอย่างการ ประยุกต์ใช้ Gene Recombinant Technology

41 41 Geneti c Maps

42 42 DNA Sequencing

43 43 Cloning Growth Hormone Gene

44 44 Gene Therapy : รักษาโรคทาง พันธุกรรม

45 45 Transgenic Animal การเตรียมฉีด DNA ด้วย microinjection เข้าไปในไข่ Transgenic mouse ( ซ้าย )

46 46 Transgenic Plants Luciferase plant พืชเรืองแสง Glyphosate- tolerant petunia

47 47 DNA Fingerprintings : Identify บุคคล / พ่อ - แม่ การเตรียม DNA Fingerpri ntings

48 48 หาพ่อ - แม่ หาคนร้ายจากผู้ ต้องสงสัย

49 49 Cell Cloning  ให้เป็น cloned animal 1. แยก cell จากสัตว์ที่โตเต็มวัยแล้ว 2. Fuse รวมกับ unfertilized egg ที่ ได้เอา nucleus ออกแล้ว 3. กระตุ้นให้แบ่งเซลล์ กลายเป็นตัว อ่อน (embryo) 4. นำฝากใส่มดลูกของสัตว์ ตัวเมียที่ พร้อมตั้งครรภ์ l

50 50


ดาวน์โหลด ppt 1. 2 Gene Engineering  การสร้าง gene ใหม่  โดยตัดต่อระหว่าง DNA จาก แหล่งที่ต่างกัน  ได้ DNA โมเลกุลใหม่ เป็น โมเลกุลผสม เรียกว่า Recombinant DNA 

งานนำเสนอที่คล้ายกัน


Ads by Google